Nat Methods | MIT美女科学家实现时空分辨转录组学揭示亚细胞RNA动力学景观

原创 M. B. 图灵基因 2023-04-28 10:11 发表于江苏

撰文：M. B.

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亮点：

1、细胞核/细胞质转录本分布的稳态由基因特异性调节机制维持。

2、RNA转录、转录后加工和分配的动力学参数相对独立。

3、RNA动力学参数可以反映不同细胞类型的共享基因的共同特性和不同基因的差异特性。

近日，麻省理工学院的王潇团队在《Nature methods》杂志上发表了名为“Spatiotemporally resolved transcriptomics reveals the subcellular RNA kinetic landscape”的文章。该文章报告了TEMPOmap——一种在单细胞水平上揭示跨时间和空间的亚细胞RNA谱的方法，揭示了RNA错综复杂的亚细胞动力学，解决了现有转录组学方法的局限性问题。TEMPOmap整合了脉冲追踪代谢标记与高度多重的三维原位测序，可以同时剖析单个RNA分子的年龄和位置。作者利用TEMPOmap构建了从转录和易位到降解的亚细胞RNA动力学景观，发现了“动力学基因簇”，为揭示新的时空基因调控原理提供了门户。

细胞状态和功能由基因表达的时空调控决定，这种异质表达部分是通过精确的mRNA代谢和随时间推移的运输来实现的。在单细胞水平上，系统地分析跨时间和空间的转录组能力对于理解细胞和组织中的转录和转录后基因调控机制至关重要。然而，目前的转录组学方法无法同时捕获RNA图谱的空间和时间依赖性。

在这里，为了在时间和空间上提供RNA生命周期的系统单细胞分析，作者介绍了一种方法——时间分辨原位测序和作图（TEMPOmap），可以在亚细胞分辨率下随时间时空演变跟踪转录组学的方法。TEMPOmap同时整合了转录组学的脉冲代谢标记和选择性扩增。利用脉冲追踪标记，能够在RNA生命周期中同时追踪成百上千个基因的关键动力学参数，包括转录、衰变、核输出和细胞质转位的速率。利用这些时空参数，作者发现不同基因的mRNA在RNA生命周期的不同步骤和不同细胞周期阶段受到不同的调控，最终发挥基因功能。

1、时空分辨转录组学——TEMPOmap

TEMPOmap用5-乙炔基尿苷（5-EU）代谢标记培养细胞，使得在标记的mRNA上增加了一个生物正交的化学标记。接下来，作者为每个mRNA物种设计了一个三探针组（splint, padlock and primer），选择性地生成来源于代谢标记RNA的互补DNA扩增子，只有同时与所有三类探针结合的mRNA的互补DNA扩增子才会被扩增，因此允许通过两步阈值策略以标记和序列特异性的方式选择性检测标记的mRNA群体。

为实现高度多重转录组检测，将原位生成的cDNA扩增子文库嵌入到水凝胶基质中进行几个循环的荧光成像，通过动态退火和连接进行测序，解码基因编码条形码，循环完成后，对扩增子reads进行配准、解码并进行3D分割。实现同时解析成百上千个基因的亚细胞和单细胞分析。

2、RNA寿命中的亚细胞RNA动力学景观

为了进一步量化转录和转录后加工不同阶段的动力学，作者评估了RNA寿命内所有检测到的转录本的4个关键动力学常数：合成（α）、降解（β）、核输出（λ）和胞浆转位（γ）。作者将结果与已发表的使用EU标记的单细胞测序数据集作为基准，结果显示α和β值的中度相关性为0.30，与独立的单细胞测序数据集相当。

之后，作者对936个基因的四个参数进行了成对相关性分析，发现每对参数之间的整体相关性较弱，提示RNA转录、转录后加工和分配的动力学参数相对独立，并提出细胞周期分辨RNA动力学景观：RNA产生的早期与α高度相关；细胞核转录后加工过程中与λ具有中度相关性；RNA生命周期接近结束时与γ的相关性较弱。除此之外，作者的分析表明λ在不同RNA物种之间差异很大，表明细胞核/细胞质转录本分布的稳态是由基因特异性调节机制维持的。

3、基于基因功能差异的RNA动力学策略

作者对800个基因进行了聚类，聚类分析发现了5个不同动力学景观的动力学基因簇有明显的单细胞表达和随时间分布的亚细胞。GO分析表明，5个簇与截然不同的生物学和分子功能相关。之前的研究表明，许多编码膜结合蛋白的mRNA锚定在内质网表面进行局部蛋白合成。作者推断编码这些膜蛋白的RNA也可能在动态水平上被调节，通过空间和时间定位控制以细胞周期依赖的方式执行，结果作者发现内质网定位的蛋白质合成在G1期更活跃。

4、TEMPOmap在诱导多能干细胞和原代细胞中的适用性

最后，作者研究了是否可以使用TEMPOmap来研究异质细胞类型中mRNA在不同阶段的时空动力学。为此，作者设计了两组三探针，并将TEMPOmap应用于两种不同的生物系统：人诱导的多能干细胞衍生心肌细胞（hiPSC-CMs）和源自新生儿包皮的原代人类皮肤细胞，结果观察到hiPSC-CMs和原代皮肤细胞中RNA的强烈空间重定位。

使用每种细胞类型的已知标记基因，作者确定了hiPSC-CMs培养物中的心肌细胞和心肌成纤维细胞群；皮肤细胞培养物中的黑素细胞、角质形成细胞和成纤维细胞群。然后，作者概括了每种细胞类型内单细胞转录组谱在不同时间的轨迹。对于hiPSC-CMs数据集，作者确定了三个动力学基因组。对于原代皮肤细胞数据集，动力学簇显示了不同细胞类型的每个基因簇内一致的RNA动态模式，表明RNA动力学参数反映了不同细胞类型的共享基因的共同内在特性。

技术路线

总体而言，TEMPOmap是一种新的原位转录组学平台，可同时分析单细胞中的时间和空间分辨转录组学，这是一种以前从未实现的亚细胞分辨率的多模态单细胞转录组学技术。作者证明了它能够随着时间的推移系统地检测转录物的亚细胞分配和细胞质易位。更重要的是，作者的研究提供了单细胞水平上RNA亚细胞动力学的完整景观，并揭示了RNA动力学如何促进细胞功能，如细胞周期进程。

教授介绍

王潇，麻省理工学院化学系助理教授，麻省理工学院-哈佛大学博德研究所核心成员。2019年王潇教授开始开发并应用新的化学、生物物理和基因组工具，以更好地从分子水平了解大脑的功能障碍。在斯坦福，她开发了将测序与成像相结合的分析完整组织中RNA的综合方法，揭示了大脑中各种细胞类型的位置。

参考文献

Ren J et al. “Spatiotemporally resolved transcriptomics reveals the subcellular RNA kinetic landscape” Nat Methods. Apr 10 2023. doi: 10.1038/s41592-023-01829-8.