上次我们讲解了怎么通过IHC score值对免疫组化进行分析，但是也有的同学会发现IHC score并不适用于所有的免疫组化片子，阳性表达较少的情况下，IHC Profiler可能会判定为阴性，这就导致我们无法拥有一个较好的表征数值。那在这种情况下，我们可以通过测定免疫组化片子阳性信号的平均光密度值来进行表征，目前该方法也被多数高分文章所采用认可[1-4]。
1.什么是平均光密度
累积光密度（IOD），就是把图片上每个棕色点的光密度值全部累加起来得到的值。
平均光密度（Mean density）就是用IOD除以有效目标分布区域的面积（Area）所得到的值。
即平均光密度=IOD值/Area值
免疫组化照片主要是比较组别间（e.g.癌和癌旁、用药前和用药后）平均光密度的大小。
2.实操展示
计算平均光密度最常用的图像分析软件：Image-Pro Plus（术业有专攻，下载问度娘哈）。
（1）首先，我们在软件里打开一张免疫组化照片。
（2）选择下图按钮，选择“Measure” →Select Measurements →选择“Area”、“Density（mean）”、“IOD” →OK。
（3）选择“Select Color”，点击取色器（下图红框）选择目标区域（阳性表达量比较高的区域），如果选错或效果不好，点击撤回（下图绿框），也可以点击擦除器（下图蓝框）进行局部擦除。
（4）阅览全片，检查阳性表达区域是否已经圈选完毕。之后选择右下角的“Close”关闭页面。再选择“Count”进行数据统计（注意这步一定不能忘记，否则后面无数据）。
（5）选择导航栏的“Measure”→“Data Collector”，在“Layout”种选择参数，分别是“Image 的Name”、“count/size的Area（Mean）”、“count/size的Density（Mean）”、“count/size的IOD（Mean）”，确认无误后点击“Collect Now”，在Date list中查看数据。
（6）通过“Data Collector”的“Export”可以导出txt格式的数据。
（7）计算平均光密度值。
该图片的平均光密度=5606.87/53.03 = 105.73
参考文献
[1] Ma DN, Chai ZT, Zhu XD, Zhang N, Zhan DH, Ye BG, Wang CH, Qin CD, Zhao YM, Zhu WP, Cao MQ, Gao DM, Sun HC, Tang ZY. MicroRNA-26a suppresses epithelial-mesenchymal transition in human hepatocellular carcinoma by repressing enhancer of zeste homolog 2. J Hematol Oncol. 2016 Jan 6;9:1. doi: 10.1186/s13045-015-0229-y .
[2] Zhang L, Niu H, Ma J, Yuan BY, Chen YH, Zhuang Y, Chen GW, Zeng ZC, Xiang ZL. The molecular mechanism of LncRNA34a-mediated regulation of bone metastasis in hepatocellular carcinoma. Mol Cancer. 2019 Jul 26;18(1):120. doi: 10.1186/s12943-019-1044-9 .
[3] Liu W, Zhou L, Zhou C, Zhang S, Jing J, Xie L, Sun N, Duan X, Jing W, Liang X, Zhao H, Ye L, Chen Q, Yuan Q. GDF11 decreases bone mass by stimulating osteoclastogenesis and inhibiting osteoblast differentiation. Nat Commun. 2016 Sep 22;7:12794. doi: 10.1038/ncomms12794 .
[4] Cao MQ, You AB, Zhu XD, Zhang W, Zhang YY, Zhang SZ, Zhang KW, Cai H, Shi WK, Li XL, Li KS, Gao DM, Ma DN, Ye BG, Wang CH, Qin CD, Sun HC, Zhang T, Tang ZY. miR-182-5p promotes hepatocellular carcinoma progression by repressing FOXO3a. J Hematol Oncol. 2018 Jan 24;11(1):12. doi: 10.1186/s13045-018-0555-y .B1
