2021年11月，Hardikkumar Jetani等在BLOOD上发表文章“Siglec-6 is a novel target for CAR T-cell therapy in acute myeloid leukemia”，阐述了唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素（siglec）-6成为急性髓系白血病（AML）的CAR-T治疗靶点的可行性。原文
唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素（Siglec）形成一个细胞表面受体超家族，在造血系统中表达，并与人类免疫细胞中的抑制性信号传导有关。Siglec超家族的成员正在被研究作为嵌合抗原受体（CAR）T细胞免疫疗法的靶抗原，包括B细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL）中的Siglec-2（CD22）和急性髓性白血病（AML）中的Siglec-3（CD33）。CD22特异性CAR-T细胞已在用CD19 CAR-T淋巴细胞治疗后复发的B-ALL患者中显示出临床活性并再次诱导缓解。CD33特异性CAR-T细胞已被证明在AML的临床前模型中有效，并已在临床试验中进行评估，因为CD33在AML母细胞上普遍表达。然而，靶向CD33也存在挑战，包括由于CD33在正常造血干细胞和祖细胞（HSPCs）上的表达，预测正常造血会被消融，以及与大量AML细胞相比，CD33在AML干细胞上的表达较低。AML中CAR-T细胞还有其他候选抗原，包括CD123和FLT3，它们共同面临在正常HSPCs以及CLL-1、CD7和叶酸受体β上表达的挑战，这些细胞在AML母细胞上不均匀表达，在AML干细胞上低水平表达。因此，人们一直在努力鉴定新的靶抗原和相应的CAR结合结构域，这些抗原在AML中具有潜在的治疗作用。
在本研究中，我们评估了Siglec-6作为AML中CAR-T细胞的新靶抗原。Siglec-6已被鉴定为人单克隆抗体（mAb）JML-1的独特靶抗原，其已从B细胞慢性淋巴细胞白血病（B-CLL）患者的异基因造血干细胞移植后（allo-HSCT）抗体库中分离。Siglec-6由3个细胞外免疫球蛋白（Ig）结构域和2个细胞内免疫受体酪氨酸基抑制基序（ITIM）组成，与Siglec-3（CD33）的分子结构非常相似。由于ITIM，Siglec-6被认为是免疫细胞中激活途径的调节因子，类似于其他与CD33相关的Siglec。在正常细胞和组织中，据报道，Siglec-6在B细胞、肥大细胞、和胎盘中表达。然而，与其他Siglec家族成员不同，Siglec-6被认为在T细胞、自然杀伤（NK）细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和单核细胞中不存在。在恶性细胞和组织中，据报道，Siglec-6在CLL、黏液相关淋巴组织淋巴瘤、克隆性肥大细胞疾病、和甲状腺癌中表达，以及正常发育和成熟的造血细胞。数据显示Siglec-6在AML中普遍表达，而在正常HSPCs中不存在。我们还表明，在体外和体内的临床前模型中，被基因工程化以表达由JML-1 mAb的可变轻链（VL）和可变重链（VH）组成的Siglec-6 CAR的T细胞赋予了针对AML和CLL的特异性和有效的抗白血病功能。
材料和方法
流式细胞术分析Siglec-6的表达
使用别藻蓝蛋白缀合的小鼠抗人Siglec-6mAb（克隆767329，R&D Systems，Minneapolis，MN）（原发性AML）或REAfinity抗人Siglec-6（克隆REA852，Miltenyi Biotec，Bergisch-Gradbach，Germany）（所有其他细胞类型）和相应的同种型对照（小鼠IgG1或REA对照抗体[S]，人IgG1）分析Siglec-6（CD327）的表达。简言之，将1×106个细胞洗涤，重悬于100μL磷酸盐缓冲盐水和0.5%胎牛血清中，并用抗Siglec-6mAb或同种型对照在4°C下染色30分钟。在用克隆767329染色之前，用人IgG（Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA）在4°C下进行Fc阻断20分钟。7-氨基-维甲酸霉素D（7-AAD）用于区分活细胞和死细胞。
U937异种移植物模型的体内实验
机构动物护理和使用委员会（维尔茨堡大学）批准了所有体内实验。从Charles River（Sulzfeld，Germany）购买NOD.Cg-PrkdcsidIl2rgtm1WJ/SzJ（NSG）小鼠（雌性，6-8周龄），并用2×106萤火虫萤光素酶（FLUC）-绿色荧光蛋白（GFP+）U937细胞或1×106 MOLM-13细胞接种。小鼠被随机分配到治疗组，并在指定的时间点接受5×106 T细胞（即在200μL磷酸盐缓冲盐水和0.5%胎牛血清中的2.5×106 CD4+和2.5×106 CD8+）。使用IVIS Lumina成像系统（PerkinElmer，Waltham，MA）在腹膜内施用D-荧光素底物（0.3mg/g体重）（Biosynth，Staad，Switzerland）后，每周进行一次生物发光成像（BLI）。通过使用Living Image软件（PerkinElmer）分析生物发光图像。
结果
Siglec-6 CAR-T细胞识别并消除AML细胞系
我们产生了一个单链可变片段（scFv），该片段包含抗Siglec-6mAb JML-1的VH和VL链，并衍生出2个具有CD28和4-1BB共刺激的类似Siglec-6 CAR。在制造结束时表达Siglec-6 CAR的T细胞的生长动力学和产量与未转染（UTD）的T细胞相似。我们评估了Siglec-6在一组AML细胞系中的表达，并通过流式细胞术发现了不同程度的Siglec-6表达（归一化平均荧光强度[NMFI]范围，8.22-0.76）：在U937和TF-1 AML细胞上为高，在MV4上为中/低；和MOLM-13 AML细胞，并且在K562和Kasumi-1细胞上非常低/检测不到。通过定量聚合酶链式反应（qPCR）和超分辨率显微镜证实了这些AML细胞系之间Siglec-6表达的层次结构。为了提供匹配的阳性对照细胞系，我们改造K562细胞以稳定表达Siglec-6。
接下来，我们试图确定Siglec-6 CAR-T细胞对AML靶细胞的特异性。我们证实CD8+Siglec-6 CAR-T细胞具有针对U937、MV4的特异性细胞溶解活性；和MOLM-13 AML细胞系和K562/Siglec-6细胞，具有从高到低效应物-靶点（E:T）比率的剂量-反应关系（范围，10:1到1:4）。我们使用UTD T细胞作为参考，CD19 CAR-T细胞作为特异性靶细胞裂解的对照。在用U937、MV4刺激后，我们观察到CD8+和CD4+Siglec-6 CAR-T细胞的生产性细胞因子分泌和增殖；和MOLM-13 AML细胞系以及K562/Siglec-6细胞。我们未观察到Siglec-6 CAR T细胞对K562和Kasumi-1细胞的特异性反应性，这与qPCR和dSTORM未观察到的Siglec-6表达一致。为了增加Siglec-6在AML细胞系表面的表达和Siglec-6 CAR的特异性的额外置信度，我们产生了等基因U937，MV4；和MOLM-13 Siglec-6敲除细胞系，并证实Siglec-6 CAR-T细胞的识别被消除）。线性回归分析显示，在4小时测定期内，细胞溶解的速度和程度与AML细胞系上Siglec-6的表达相关（R2=0.91；P=.0009）。总体而言，表达具有CD28与4-1BB共刺激结构域的Siglec-6 CAR构建体的CD8+T细胞的细胞溶解活性同样有效。总之，数据显示Siglec-6是AML细胞系上的普遍靶标，并通过表达Siglec-6 CAR的T细胞赋予特异性识别。
Siglec-6在原代AML母细胞上表达，包括AML干细胞
我们评估了Siglec-6在来自连续20名AML成年患者的原发性AML母细胞上的表达。该系列包括原发性和继发性AML患者，以及具有不同分子和遗传亚型的新诊断和既往治疗（复发/难治性）AML患者。为了评估Siglec-6 CAR-T细胞在该队列中的潜在适用性，我们使用流式细胞术分析（读数：Siglec-6%表达阈值的NMFI，≥1.1）和Siglec-6 CAR-T细胞的识别（读数：AML母细胞的细胞裂解阈值，≥30%）进行了双标准评估。通过使用流式细胞术，我们检测到AML母细胞上不同程度的Siglec-6表达，并根据NMFI对患者进行排名（范围，5.79-0.89）。在细胞裂解分析中，我们检测到Siglec-6+AML母细胞的快速有效消除。令人感兴趣的是，我们还观察到NMFI在低于表达阈值的AML样品中的细胞溶解。这些数据表明，在我们的标准方案中，用直接偶联的mAb通过流式细胞术进行的检测不够灵敏，不足以检测可能足以触发Siglec-6 CAR的非常低水平的Siglec-6表达。事实上，使用生物素化的抗Siglec-6 mAb并用链霉亲和素藻红蛋白扩增，能够更好地检测低水平Siglec-6表达。在20名患者中，每名患者至少满足2项标准中的1项；在15名患者中，两项标准均得到满足。与AML细胞系的观察结果类似，线性回归分析显示Siglec-6表达与Siglec-6 CAR-T细胞对AML母细胞的细胞溶解之间存在相关性（R2=0.45；P=0.0018）。我们还考虑了AML干细胞的亚群，据说该亚群具有增强的致白血病潜力和对治疗的耐药性，并且包含在AML母细胞的CD45dimCD34+CD38部分中。通过使用流式细胞术，我们发现AML干细胞表达的Siglec-6水平类似于甚至高于大量AML母细胞的水平，并且对Siglec-6 CAR-T细胞的细胞裂解同样敏感。
为了证实我们的数据，我们从3名AML患者中产生了Siglec-6 CAR-T细胞。Siglec-6 CAR-T细胞可以很容易地产生，其产量和纯度与我们在来自健康供体的细胞中观察到的相似。在每个患者中，Siglec-6 CAR-T细胞在用自体AML母细胞和AML细胞系刺激后，通过高水平的细胞溶解、细胞因子分泌和增殖，赋予了强大的抗白血病反应性。总之，这些数据表明Siglec-6是AML中CAR-T细胞的相关靶点，并证明Siglec-6CAR T细胞在体外识别和消除原代AML母细胞。
Siglec-6 CAR-T细胞在体内AML异种移植模型中有效
我们用FLUC+GFP+U937 AML细胞接种NSG小鼠，并通过流式细胞术评估外周血中循环AML细胞，并通过BLI评估髓外和髓外AML表现，在6天内观察到系统性白血病的快速发展。在第6天，我们用Siglec-6_28z或Siglec-6Bz-CAR T细胞或UTD T细胞处理小鼠。到第14天，我们观察到白血病细胞从外周血中清除，BLI降低了系统性白血病负担。Siglec-6 CAR-T细胞产物（即CD28与4-1BB共刺激）均诱导了100%的应答率（8只小鼠中的8只）。在第10天和第14天，在外周血中可检测到Siglec-6CAR T细胞，并且Siglec-6Bz与Siglec-6_28z CAR T细胞相比具有更好的植入和体内扩增（在第14天：0.99%vs 0.25%，P =0 .0002）。第21天，外周血AML持续缓解；然而，在所有小鼠中，我们观察到向髓和髓外病变投射的残余（甚至增加）BLI信号，在接受Siglec-6_28z-CAR-T细胞的小鼠中尤其明显。因此，我们在第21天向所有治疗组施用第二剂Siglec-6 CAR-T细胞，并且能够通过BLI信号进一步降低白血病负担。到第35天，所有接受Siglec-6 CAR-T细胞的小鼠的BLI信号都与基线时（即白血病植入前）相同。通过进一步的随访，我们观察到8只接受Siglec-6Bz-CAR-T细胞的小鼠中有8只（100%）和8只接受了Siglec-6_28z-CAR-T细胞的小鼠的6只（75%）持续完全缓解。在Siglec-6_28z-CAR组的8只小鼠中的其余2只（25%）中，我们在第56天观察到BLI信号增加，投射到髓外基因座。在第56天观察期结束时，所有用Siglec-6 CAR T细胞处理的小鼠都是活的，并且在外周血、骨髓或脾脏中没有检测到AML细胞。所有用UTD T细胞处理的小鼠都显示出有害的白血病进展，并且必须在第21天之前实施安乐死。我们在接种了MOLM-13细胞（Siglec-6低表达）的NSG小鼠中进行了额外的实验。Siglec-6 CAR-T细胞的治疗具有抗白血病作用，并带来显著的生存益处，但与NSG/U937模型（Siglec-6高表达）相比，其效果明显较差。
我们感兴趣的是阐明Siglec-6Bz与Siglec-6_28z CAR T细胞相比具有优异的体内性能背后的潜在机制。在先前的报道中，4-1BB共刺激已显示在CAR-T细胞中诱导有利于体内持久性的独特代谢程序。因此，我们进行的代谢分析显示，与Siglec-6_28z CAR T细胞相比，Siglec-6Bz的基础耗氧量增加（表明氧化磷酸化），细胞外酸化率增加（表明有氧糖酵解），表明其具有优越的生物能量能力。总之，数据表明Siglec-6 CAR-T细胞在体内具有强大的抗白血病作用，并且能够诱导侵袭性全身AML的长期缓解。数据还表明，Siglec-6Bz而不是Siglec-6_28z CAR-T细胞是临床的首选产品。
Siglec-6在正常HSPCs中不表达
我们试图评估Siglec-6 CAR-T细胞的靶向/肿瘤外反应性潜力，并专注于发育和成熟的正常造血细胞。首先，我们从5名健康捐献者的外周血中获得了粒细胞集落刺激因子动员的CD34+CD38-造血干细胞和CD34+CD38+造血祖细胞。我们进行了流式细胞术分析，并在所有5名健康供体的正常HSPCs上检测到CD123、CD33、CLL-1和FLT3，与之前的报告一致。令人鼓舞的是，Siglec-6是唯一在所有5例供体的HSPCs上未检测到的抗原。我们通过dSTORM超分辨率显微镜和qPCR在信使RNA转录水平上证实了HSPCs表面不存在Siglec-6。为了进一步评估HSPCs靶向识别的潜力，我们应用了流式细胞术分析和Siglec-6 CAR-T细胞识别的标准，我们也在评估原发性AML母细胞时应用了该标准。我们没有通过流式细胞术检测到Siglec-6（NMFI<1），并且在共培养试验中Siglec-6 CAR-T细胞对HSPCs没有反应性，即使在24小时内的高E:T比率下也是如此。我们使用CD123 CAR-T细胞作为阳性对照，不出所料，发现HSPCs快速缺失。我们对CAR-T细胞和HSPCs进行了24小时共培养，以评估它们启动谱系发育的能力，并在用Siglec-6 CAR-T细胞和UTD-T细胞处理后发现了类似的集落形成模式。
其次，我们分析了健康捐献者（n≥7）外周血中成熟的正常造血细胞，并在一部分正常B细胞上检测到Siglec-6的高表达，在一部分髓细胞上检测出弱表达，在T细胞、NK细胞或NK T细胞上没有表达。在正常B细胞群体中，Siglec-6在记忆B细胞上可检测到高水平，在幼稚和未成熟B细胞上检测到极低水平。髓系细胞的详细亚群分析显示，嗜碱性粒细胞表达Siglec-6，而中性粒细胞和单核细胞为Siglec-6阴性。我们在体外从单核细胞中产生的髓源性树突状细胞也是Siglec-6阴性的。根据表达分析，我们发现与Siglec-6 CAR-T细胞共培养的B细胞和嗜碱性粒细胞部分缺失，而中性粒细胞和单核细胞没有受到影响。我们使用胎盘（作为参考）和脾脏（作为对照）分析了Siglec-6在成人必需组织中的表达，胎盘已知表达Siglec-6，脾脏预计由于B细胞和嗜碱性粒细胞的浸润而产生信号。脑、乳腺或肝组织中没有信号，回肠、结肠、肺、肾、心脏、卵巢和前列腺组织中偶尔出现的细胞信号非常低，与浸润性免疫细胞一致。总之，这些数据表明Siglec-6在正常HSPCs上不表达，并且靶向Siglec-6不会干扰体外造血谱系发育。Siglec-6在记忆B细胞和嗜碱性粒细胞上表达，这表明患者的靶向/非靶向肿瘤反应性可能有限。
此外，作者还发现Siglec-6 CAR-T细胞对CLL中的恶性B细胞有效。
文章最后总结
总之，我们提出Siglec-6作为AML中CAR-T细胞的新靶点。这些数据表明，Siglec-6 CAR-T细胞治疗白血病细胞上高表达Siglec-6的患者是有效的，并且毒性可以接受。
