PCR是分子生化学生必备技能，简单朴实但是必不可少，是许多分子实验进行下去冲锋员。下面我们就一起来看看引物设计：

基本三原则是：引物与模板的序列要紧密互补；其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构；再次引物不能在模板的非目的位点引发 DNA 聚合反应(即错配)。

1.引物的长度一般为20-25bp：根据后续选择连接方式进行调整，双酶切后T4连接可以完全遵循20-25bp；同源重组需要设置同源臂和遵循酶说明书（一般同源臂含有15bp以上）

2.GC含量为40%-60%：过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的 GC 含量不能相差太大。最好能够实现四种碱基均匀分布。若是引物存在严重的GC倾向或AT倾向则可以在引物5’端加适量的A、T或G、C尾巴（引物的5′端限定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大）

3.正向引物和反向引物的TM值要尽量接近，引物自身及引物之间不应存在互补序列：Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度，有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。

4.引物3'端不能选择A，最好选择T：引物3′端错配对扩增产物的影响是有一定规律的。A错配使产量下降至1/20，A∶G和C∶C错七下降至1/100.引物A：模板G与引物G：模板A错配对PCR影响是等同的。

5、碱基要随机分布：引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。

6、引物自身不能有连续4个碱基的互补：引物自身存在互补序列，致使引物自身会折叠成发夹状结构，这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。若用人工判断，引物自身连续互补碱基不能大于4bp.

7、引物之间不能有连续4个碱基的互补：两引物之间不应具有互补性，尤其需要避免3′端的互补重叠以防引物二聚体的形成。一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。

8、引物3′端不可修饰：引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任何修饰。3′端也不能有形成任何二级结构可能，除在特殊的PCR（AS-PCR）反应中，引物3′端不能发生错配。

9、引物5′端可以修饰：引物的5′端限定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光等；引入蛋白质结合DNA序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。

10、密码子简并性：如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。

软件推荐使用：snapgene；primer premier 6；NCBI 

最近带师弟师妹做PCR有感，网上经验结合实际经验总结，有需要可以参考哦。

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                                                                                                                                                                                  Monster