http://mooc.guokr.com/note/16694/
1.1 介绍
1.2 DNA结构
1.3 DNA复制
快速、完全、精确
1.4 The Chemistry of DNA Replication
DNA聚合酶催化了反应进行
PTJ:primer template junction
引物的3‘端被延长
1.5The DNA Polymerase Active Site
DNA聚合酶催化至少16种反应,但只有一个活性位点
DNA双链构成
1.6The Structure of DNA Polymerase
1.7Catalysis by the Fingers of DNA Polymerase
1.8Mistakes by DNA Polymerase
每合成十万对碱基会发生一个错误
1.9校对核酸外切酶Proofreading Exonucleases
修正错误:移除错配的核苷酸
2.1Incorporation Assay核素掺入法
检测DNA活性的方法。检测聚合物的合成情况。
标记dNTP,可以用荧光或放射性标记。在每个时间点加入SDS或EDTA来终止反应。从dNTP中分离DNA并测量其中包含了多少标记的dNTP。那么怎样从dNTP中分离DNA呢?需要用到下面的方法:
2.2Filter Binding Incorporation Assay
把dNTP根据电荷从滤纸上洗脱。因为DNA不容易被洗脱,而dNTP容易被洗脱
2.3Electrophoresis Incorporation Assays凝胶电泳
- 加热将DNA变性
- 如果是琼脂糖ararose则添加NaOH,如果是聚丙烯酰胺,则添加尿素。为了防止退火
- 可以看到产物的长度,但比较慢
2.4引物延伸实验Primer Extension Assay
2.5持续合成能力Processivity
是与聚合物酶相关的能力。与每个聚合物分子结合的酶的反应循环数。
2.6DNA Polymerase Processivity Assay
模板竞争分析,测定持续合成能力。只测量第一次合成的情况。