Cancer Discov | 衰老重塑微环境感知以促进抗肿瘤免疫

原创 huacishu 图灵基因 2022-11-04 10:11 发表于江苏

收录于合集#前沿生物大数据分析

撰文：huacishu

IF=38.272

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亮点：

1、作者着手建立调节衰老细胞免疫识别和清除的原理，以确定可用于改善癌症免疫控制的可行的衰老机制。为此，作者开发了一种新的“衰老诱导型”模型，在该模型中，肝癌细胞可以通过内源性p53的遗传调节选择性地切换到衰老状态；

2、作者表明衰老还重塑了细胞表面蛋白质组，以改变肿瘤细胞感知环境因素的方式，如II型干扰素（IFN-γ）；

3、作者的结果揭示了衰老细胞中的重组组织传感程序，该程序与SASP协同作用，提高其免疫原性潜能，从而促进免疫介导的肿瘤排斥反应。

美国斯隆—凯特林癌症研究所Scott W. Lowe教授课题组在国际知名期刊Cancer Discov在线发表题为“Senescence rewires microenvironment sensing to facilitate anti-tumor immunity”的论文。细胞衰老包括细胞周期停滞，并与分泌程序结合，在某些情况下，分泌程序刺激衰老细胞的免疫清除。使用衰老触发CD8 T细胞介导的肿瘤排斥反应的免疫活性肝癌模型，作者表明衰老还重塑了细胞表面蛋白质组，以改变肿瘤细胞感知环境因素的方式，如II型干扰素（IFN-γ）。

与增殖细胞相比，衰老细胞上调IFN-γ受体，对微环境IFN-γ超敏，并更强烈地诱导抗原呈递机制效应，这种效应也在经历治疗诱导衰老的人类肿瘤细胞中重现。在衰老细胞中干扰素-γ传感的破坏会减弱其免疫介导的清除，而不会使衰老状态或其特征性分泌程序失效。作者的结果表明，衰老细胞具有更强的发送和接收环境信号的能力，这意味着每个过程都是有效免疫监测所必需的。

在癌症中，衰老已被证明可以介导对组织生物学有益和有害的影响。一方面，衰老为癌基因引发的肿瘤形成提供了障碍，并有助于某些癌症疗法的抗肿瘤活性。另一方面，衰老肿瘤细胞在治疗后的持续存在可以产生促进复发和转移的组织环境。这些相反的生物输出的分子基础仍不清楚。

本文中作者着手建立调节衰老细胞免疫识别和清除的原理，以确定可用于改善癌症免疫控制的可行的衰老机制。为此，作者开发了一种新的“衰老诱导型”模型，在该模型中，肝癌细胞可以通过内源性p53的遗传调节选择性地切换到衰老状态。作者推断，这将模拟引发衰老的疗法效果，同时避免衰老诱导疗法对免疫细胞或组织环境的其他成分的混淆效应。

使用该模型，然后扩展到其他系统发现，除了衰老相关分泌表型（SASP）外，衰老还驱动细胞表面蛋白质组和信号程序的重塑，其方式预计将从根本上改变细胞感知和响应环境信号的方式。这一过程使得衰老肿瘤细胞中的抗原处理和呈递机制能够更稳健地上调，从而使其容易受到体内免疫监测。因此，作者的结果揭示了衰老细胞中的重组组织传感程序，该程序与SASP协同作用，提高其免疫原性潜能，从而促进免疫介导的肿瘤排斥反应。

研究衰老监测的p53可恢复免疫活性肿瘤模型

为了研究衰老如何重新编程细胞和组织状态，作者利用流体动力尾静脉注射（HTVI）技术生成由肿瘤特异性、可恢复的p53短发夹RNA（shRNA）控制的衰老诱导型肝癌模型。在该系统中，内源性p53在强力霉素（Dox）存在下通过激活与RFP相关的诱导性shRNA而被抑制（图1A），从而能够遗传控制已建立的肿瘤中的衰老。

基于先前的工作，作者预计上述系统中p53的重新激活将触发衰老并参与抗肿瘤免疫。因此，在数周的过程中，停药引发了显著的肿瘤消退，导致动物存活时间延长（图1B和1C）。停药后14天的肿瘤分析显示，p53 shRNA的预期下调和衰老相关的-β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）的积累对RAS效应物p-ERK没有任何显著影响（图1D）。因此，该系统允许有效诱导肿瘤细胞衰老。鉴于其增加的灵活性，在下面研究中使用了原位移植模型。

正如预期的那样，上述明显的肿瘤消退是免疫介导的。因此，移植到免疫受损的裸鼠和Rag2-/-Il2rg-/-（R2G2）小鼠中后产生的NSP肿瘤经历了显著的细胞抑制反应，但未能退化，R2G22动物表现出最严重的缺陷（图1E-1G）。由于裸鼠在适应性免疫方面存在缺陷，而R2G2在先天免疫方面也存在缺陷，这些结果表明，适应性免疫系统对于模型中有效的肿瘤消退是必不可少的。

衰老触发了从肿瘤免疫逃避到免疫识别的转变

为了表征衰老的肿瘤抑制性旁分泌效应，接下来描述了停药一周后肿瘤细胞的免疫微环境，其中肿瘤细胞含有p53抑制的（“增殖”）和p53恢复的（“衰老”）肿瘤细胞。与增殖对照相比，含有衰老肿瘤细胞的病变显示CD45+免疫细胞总数增加了约1.8倍（图2A）。免疫表型和组织学分析显示，这涉及淋巴细胞（B细胞、CD4+和CD8+T细胞）百分比的显著增加，以及Gr-1+髓源性抑制细胞/中性粒细胞百分比的降低（图2B）。

虽然巨噬细胞占总CD45群体的百分比保持不变，但绝对数量显著增加（图2A）。在T细胞群中，累积的CD8 T细胞显示出抗原标志物（CD44+、CD69+），并含有增加的效应细胞群（CD44+CD62L-）（图2C）。免疫环境的这种整体重塑导致携带衰老细胞的肿瘤的CD3:中性粒细胞比率显著增加，其效果与CD3:嗜中性粒细胞比例的类似增加一致，这与人类肝脏肿瘤的免疫反应性有关。组织清除后，使用三维（3D）成像可以清楚地显示重塑（图2D）。

为了确定负责衰老肿瘤细胞免疫监测的特定免疫细胞类型，作者产生了携带原位NSP肿瘤的小鼠的平行队列，并检查了在停药后耗尽各种免疫细胞群对肿瘤消退的影响。尽管靶向中性粒细胞/单核细胞（Gr1）、NK 17细胞（NK1.1）和CD4+T细胞（GK1.5）的阻断抗体没有效果，但CD8+T细胞的耗竭和巨噬细胞显著损害了肿瘤的消退（图2E）。

为了表征p53驱动的肿瘤衰老如何导致抗肿瘤免疫，在停药（8天）后对来自增殖和衰老NSP肿瘤的新鲜分离的CD45细胞进行了单细胞RNA序列分析（scRNA-seq），并使用差异丰度测试算法捕获介导该过程的免疫细胞类型内的细胞状态变化。

CD8+T细胞和巨噬细胞亚群在数量和状态上表现出显著变化，这与它们对肿瘤消退的贡献一致。关于T细胞，增殖性（p53抑制）肿瘤在CD8+T状态中显著富集，表现出功能障碍标记物（Tox、Tigit、Lag3、Ctla4、Pdcd1/PD1、Cd160）和活化标记物（Prf1）的高表达（图2F和2G）。因此，在经历消退的衰老肿瘤中，大量肿瘤组织的转录谱显示出免疫活性和细胞毒性特征。

组织学分析证实，在肿瘤衰老诱导后，积累的CD8+T细胞和F4/80+巨噬细胞经常共同富集（图2H）。总之，这些生物学和分子分析证实，肿瘤细胞衰老诱导巨噬细胞和CD8+T细胞状态变化介导的从免疫逃避到免疫监视的突然转变，从而导致产生性抗肿瘤免疫，最终导致肿瘤排斥。

衰老重塑组织传感程序和细胞表面景观

接下来，作者开始利用上述模型来理解负责使衰老肿瘤细胞对免疫系统可见的分子机制。与预期一致，p53修复显著降低了增殖基因的表达，并诱导了SASP因子的表达（图3A），包括已知刺激T细胞（Cxcl16，Il18）或巨噬细胞活化和募集（Csf2，编码蛋白GM-CSF）或之前与衰老相关的几种细胞因子（Igfbp7，Igfbp3，Pdgfa）。因此，p53恢复的NSP肿瘤细胞的衰老与稳健的SASP相关，这与上述免疫生态系统的显著重塑一致。

对差异表达基因（DEG）的亚细胞定位的检查显示，衰老的肿瘤细胞不仅增加了分泌（“胞外”，EC）SASP因子的表达，而且显示了编码表面蛋白（“质膜”，PM）的转录物表达水平的重大变化（图3B）。25%的上调的DEG编码PM蛋白，这一显著富集偏离了随机分布（图3B）。

动态PM DEG与蛋白酪氨酸激酶信号转导（Nrp1、Egfr）、细胞因子受体活性（Ifngr1）、ECM受体（Itgb3、Cd44）和离子转运蛋白（Slc12a1、Slc24a3）相关，并捕获已知的衰老相关分子（Cd44、Vcam1和Itgb2），表明衰老细胞可能具有增强的与环境相互作用和感知环境的能力（图3C）。

有趣的是，JQ1减弱了许多这些PM蛋白表达的衰老相关增加，这表明它们的诱导可能是与SASP耦合的更广泛染色质重塑程序的一部分（图3D）。值得注意的是，在一系列遗传多样性的TP53野生型和TP53突变型人肝癌细胞系中，编码PM蛋白的基因转录也发生了深刻的变化，这让人想起了观察到的细胞外（EC）SASP因子的作用（图3E）。因此，在模型中观察到的细胞表面蛋白表达的显著改变超出了p53诱导的衰老，可能是衰老状态的标志。

为了在蛋白质水平上验证PM因子在衰老中的整体重塑，作者使用生物素标记富集方法对等基因增殖和衰老的NSP肿瘤细胞进行了表面蛋白质组学，其中细胞表面蛋白用膜不可渗透的生物素标记，纯化并进行质谱分析（图3F）。

衰老诱导后通过质谱检测到的注释性细胞表面蛋白包括几种先前与衰老相关的因子（如CD44、VCAM1）、各种生长因子和细胞因子受体（如EGFR、ICAM1和IFNGR1）以及其他特征较少的因子（图3F-3H）。这些结果表明，除了分泌程序中的重组外，衰老细胞还经历了细胞表面蛋白质含量和丰度的深刻变化，这意味着衰老细胞获得了独特的微环境感知特性，可能会影响其体内状态和命运。

衰老细胞被启动以感测IFN-γ并放大IFN-γ信号

为了确定可能在功能上影响衰老细胞感知环境的途径，作者挖掘了与抗肿瘤免疫相关的衰老相关变化的转录和蛋白质组数据集。作者注意到几种IFN-γ信号的阳性调节因子，包括IFN-γ受体亚基IFNGR1和多种干扰素效应子（图4A-4C）。

除了这些Brd4敏感的上调基因外，编码IFN-γ信号负调节因子（Ptpn2、Socs1和Socs3）的转录物显著减少（图4C）。在用不同的衰老诱导剂处理的NSP肿瘤细胞中发现了类似的变化（图4C），更广泛地说，在一组13种引发衰老的人类乳腺癌、肺癌、肝癌和结肠癌细胞系中（图4D）。因此，II型干扰素信号成分表达的变化是衰老细胞的一般特征，与细胞类型、细胞基因型、种类和衰老诱导剂的性质无关。

用重组IFN-γ处理增殖和衰老的NSP细胞，并进行JAK-STAT信号激活的免疫印迹分析。尽管IFN-γ在两种状态下都显著增加了STAT1的基线水平，但无论衰老触发因素如何，衰老细胞都积累了更多磷酸化的STAT1（图4E）。如转录分析预测的，衰老也会引发PTPN2蛋白的减少，而与外源性IFN-γ的存在无关（图4E）。因此，衰老细胞更有效地激活IFN-γ信号，以响应环境中IFN-γ的极限浓度。

衰老和细胞外IFN-γ协同上调抗原处理和呈递机制

为了更好地理解IFN-γ传感对衰老程序的功能贡献，接下来比较了用低（50 pg/mL）或更高（1 ng/mL）剂量的重组IFN-γ处理的增殖和p53恢复的衰老NSP肿瘤细胞的表型和转录状态。尽管在所测试的剂量下，向增殖或衰老的肿瘤细胞添加外源性IFN-γ对任一细胞类型的生存力、增殖或SASP基因表达的影响可忽略不计（图5A），但观察到与衰老状态相关的IFN-γ途径基因表达的显着变化（图5B）。因此，衰老引发了IFN-γ转录反应的定量和定性变化。

通过RT-qPCR证实了衰老细胞中IFN-γ的扩增输出，并在更高水平的外源性IFN-γ下保持（图5C）。与上述多因素过程一致，在增殖性肿瘤细胞中未观察到这种作用，即使是那些过表达IFNGR1 cDNA或用IFN-γ治疗的肿瘤细胞。

同样与上述基因表达变化一致的是，与增殖的肿瘤细胞相比，衰老的肿瘤细胞对低水平的外源性IFN-γ的反应更强烈地上调MHC-I。因此，尽管增殖细胞和衰老细胞的MHC-I的细胞表面水平在基线水平较低，且由外源性IFN-γ诱导，但衰老细胞显示MHC-I蛋白表达显著增加（图5D）。

衰老肿瘤细胞体内过度激活IFN-γ信号通路

为了确定衰老细胞中识别的IFN-γ信号转导的体内作用，接下来采用了IFN-γ传感（IGS）报告系统，以实时直接观察细胞内IFN-γ的信号激活。该报告由一系列干扰素γ激活序列组成，与其他信号相比，该序列对II型干扰素具有特异性，随后是编码ZsGreen1荧光蛋白的cDNA序列，并与组成性表达的RFP转基因连接，以可视化转导的细胞（图6A）。

表达该构建体的NSP肿瘤细胞是RFP阳性的，并且在体外用IFN-γ治疗后，ZsGreen1信号呈剂量依赖性增加，在p53诱导或用衰老诱导药物治疗后增加（图6B）。

接下来，使用该系统监测肿瘤衰老诱导后的信号活性。如图6C所示，增殖的肿瘤细胞显示很少报告基因表达，而体内引发衰老的肿瘤细胞则显示更显著的ZsGreen1信号（图6C和6D）。这种效应与肿瘤组织提取物中IFN-γ蛋白水平的特异性增加相一致（图6E）。

为了测试衰老肿瘤中免疫细胞组成的改变（图2）是否有助于IFN-γ传感（IGS）报告子信号的增强，作者进行了体外共培养试验，允许衰老或增殖肿瘤细胞暴露于相同数量的活化CD8 T细胞，通过scRNA-seq数据确定其为体内IFN-γ的主要细胞来源（图6F-6H）。与增殖对照相比，衰老细胞仍显示ZsGreen1信号显著增加（图6I）。总之，这些数据说明衰老肿瘤细胞和免疫细胞之间的异型相互作用使肿瘤对外源性IFN-γ敏感，从而增强抗原呈递和有效的免疫监测。

衰老肿瘤细胞中IFN-γ信号传导对免疫监测是必要的

为了测试衰老相关IFN-γ传感程序对衰老肿瘤细胞免疫监测的贡献，作者研究了肿瘤细胞中IFNGR的破坏或宿主中IFN-γ的耗竭如何影响NSP肿瘤细胞在衰老诱导时的清除。事实上，IFNGR1敲除（KO）后，肿瘤消退受损（图7A和7B），这一效应对于植入Ifng-/-小鼠的IFNGR完整肿瘤更为明显（图7C和7D），并与肿瘤细胞中表面MHC-I的预期损失相关。

与已知的IFN-γ信号和肿瘤细胞MHC-I对CD8+参与的贡献一致，缺乏IFNGR1或在Ifng-/-受体中发育的肿瘤在增殖和衰老状态下比WT对应物含有更少的CD8+T细胞，同时仍诱导强大的免疫浸润，包括丰富的巨噬细胞（图7E和7F）。总之，这些数据表明，衰老细胞感知微环境IFN-γ的能力增强与SASP刺激的免疫细胞募集协同作用，使肿瘤细胞、巨噬细胞和活化的T细胞之间的异型相互作用相互增强，从而改善抗原呈递和免疫监测，从而导致有效的肿瘤退变。

讨论

作者的结果可能有助于解释衰老生物学在生理学和疾病中的悖论效应，并对衰老调节疗法的有效使用具有意义。在癌症的背景下，诱导肿瘤细胞衰老的疗法—一种细胞抑制程序—可以触发免疫介导的肿瘤消退或使肿瘤对免疫检查点阻断重新敏感，但这些并不是普遍的结果。因此，SASP的异质性或IFN-γ的感应和输出可能会影响此类治疗在患者中的有效性。

与这一概念一致，特定SASP谱的治疗驱动诱导预测了卵巢癌患者亚组的患者结局。相比之下，通过提高衰老细胞对IFN-γ的敏感性来增强其免疫监测的策略可能有助于将程序输出偏向于肿瘤细胞排斥。作者设想，在治疗前和治疗后肿瘤活检中研究这一和其他组织重塑和传感程序，可能会揭示新的反应生物标志物和组合策略，以改善癌症的临床管理。

教授介绍

Scott W.Lowe是斯隆-凯特琳研究所癌症生物学和遗传学项目的成员。Lowe博士的工作集中在肿瘤抑制基因p53上，该基因在大约一半的癌症中发生突变。他的研究表明，p53的变化如何导致肿瘤的发展，以及p53的破坏如何影响肿瘤对治疗的反应，从而导致耐药性。

最近，Lowe博士制定了策略，以识别许多新的肿瘤抑制基因，以及癌症进展所需的持续活性以及其抑制导致癌症消退的基因。他的研究还集中于开发小鼠模型，以了解癌症的进展和对治疗的反应。其中一些模型使研究人员能够理解细胞凋亡（程序性细胞死亡）和衰老（生物老化），从而使这些过程能够恢复到癌细胞中，从而允许传统的化疗药物破坏它们。此外，Lowe博士还使用了一种名为RNA干扰的技术来更密切地调节小鼠基因的表达，使基因改变更精确、更特异。这种方法还使Lowe博士能够寻找新的癌症药物或药物组合的治疗靶点。

参考文献

Chen HA, Ho YJ, Mezzadra R, et al. Senescence rewires microenvironment sensing to facilitate anti-tumor immunity. Cancer Discov. 2022;CD-22-0528. doi:10.1158/2159-8290.CD-22-0528