更新20251118

基础知识-研究方法-案例

第一部分：基础知识：

1.基础知识（背景）：
自噬(autophagy)是由溶酶体（lysosome）和自噬体（autophagosome）结合形成的自噬溶酶体（autolysosome），利用自噬体运输和递送、溶酶体选择性地清除自身受损、衰老或过剩的胞质成分和细胞器，自噬降解后的产物可用于新蛋白合成、能量产生、糖异生等过程。本质上是自噬体寻找和运输物质给溶酶体并形成一个整体自噬溶酶体后把分解的小分子供机体继续使用。（没用物质组成自噬体，后被溶酶体分解为可用的单组份）

重点关注：1-诱导与形成位置：粗面内质网（ER）、高尔基体、线粒体、质膜等来源的膜；2-调控蛋白（自噬体形成）：Atg蛋白，酵母中已发现35种Atg蛋白，其中 Atg1-10、12-14、16、18及Atg17、29、31为 “核心Atg蛋白”，它们也参与过氧化物酶体自噬（pexophagy）等其他自噬相关途径。

（备注：）真核细胞降解系统：

蛋白酶体：降解具有高选择性，通常仅识别泛素化底物（主要是短寿命蛋白质）。

溶酶体：降解模式更复杂，胞外物质和质膜蛋白可通过内吞途径被运至溶酶体降解，胞质成分和细胞器则能通过自噬作用被运至溶酶体降解

自噬示意流程图

2. 分类：

维度1：按照真核细胞将胞内物质运送到溶酶体降解的过程（核心依赖 Atg 蛋白家族调控），主要分为三类，巨自噬Macroautophagy（主要类型，常简称 “自噬”）、微自噬Microautophagy、分子伴侣介导的自噬（也叫介导自噬Chaperone-mediatedautophagy，CMA）。这个分类可理解为进入溶酶体的方式分类（机制维度）。

维度2：按降解的特异性划分为非选择性自噬和选择性自噬（如线粒体自噬Mitophagy、聚集体自噬Aggrephagy)，这个跟维度一是两个分类。

维度1：大自噬、小自噬和伴侣自噬CMA

维度2：按照特异性分类

3. 分子机制（大自噬）

（1）启动：营养丰富时，mTOR复合物1（mTORC1）抑制ULK1（Atg1同源物）复合物；自噬诱导后，mTORC1解除抑制，ULK1复合物（含ULK1、Atg13、FIP200、Atg101）激活并转移至粗面内质网（ER）特定结构域。

（2）成核起点（自噬体启始膜结构）：激活的ULK1转移到ER后，招募III类PI3K复合物（含Beclin 1、Atg14(L)/barkor、Vps15、Vps34、Ambra1）到内质网膜，Vps34激酶催化膜上的磷脂酰肌醇（PI）发生磷酸化，生成 PI3P（信号富集区）。此时就相当于自噬体形成有场所了。此过程受RalB和含Exo84的外排体复合物促进；营养丰富时Beclin 1与ER相关Bcl-2结合，饥饿时JNK1磷酸化Bcl-2使其释放，Beclin1进而参与该激酶复合物组装。

（3）成核： PI3P招募下游含有PI3P结合结构域的蛋白到成核位点，如WIPI蛋白被招募到PI3P富集区（即omegasome）→ 成核完成。此时WIPI蛋白就像一个包工头，会进一步招募其他负责膜延伸的“工人”，比如负责脂化的ATG蛋白和ATG9囊泡。此时为成核状态了，位点在内质网上的omegasome。PI3P形成后招募双 FYVE 结构域蛋白 1（DFCP1），促进 ω 体（omegasome）形成，自噬体由此产生。

简短汇总：ULK1激活转移至ER（起始信号），PI3P生成（成核场所，项目负责者）、招商到WIPI蛋白这个包工头

（4）膜扩展/变大：

I. 膜提供者：ATG9和其他膜来源扮演重要角色，其中ATG9作为唯一的跨膜自噬蛋白，它从反式高尔基体网络等来源携带膜脂，通过穿梭运输为正在延伸的成核提供膜材料。

II. WIPI蛋白募集ATG蛋白为复合物ATG12-ATG5-ATG16L1；功能-决定膜弯曲度和作为E3连接酶催化LC3脂化。

III. 膜上货物受体合成LC3-II（包括膜蛋白化-脂化）：体系内的ProLC3尾巴被蛋白酶ATG4切掉形成胞质中可溶的LC3-I，随后被E1酶ATG7 激活，之后被传递给E2酶ATG3，最后在ATG12-ATG5-ATG16L1复合物的催化下，LC3-I与膜上的磷脂酰乙醇胺共价结合，形成LC3-II，完成脂化（有可溶蛋白变为膜蛋白）。LC3-II目的是货物识别与招募（选择性自噬的关键），因是自噬货物受体（如p62/SQSTM1, NBR1）的锚定点，即这些受体一端连接着待降解的货物（如受损的线粒体、蛋白聚集体），另一端直接结合LC3-II，这样，货物就被精准地“拖”进正在形成的自噬体里。如LC3-II是货物受体蛋白（如p62/SQSTM1, NBR1）的锚定点，这些受体连接被降解的货物（如蛋白聚集体、受损线粒体）和自噬膜，实现选择性自噬。

（备注：此时的膜：变大、弯曲、且含有结合货物的LC3-II）

（5）自噬体成熟（包裹与闭合）：隔离膜持续延伸至两端相遇并闭合，形成完整的双层膜自噬体（内层膜包裹底物，外层膜面向胞质）。自噬体闭合后，外膜上的ATG蛋白（如ATG12-ATG5-ATG16L1复合物）会解离并回收，而内膜上的LC3-II在自噬体与溶酶体融合前被ATG4 切割回收。残留在内的LC3-II在溶酶体中被降解。

（备注：此时为成熟自噬体）

（6）自噬体与溶酶体融合为自噬溶酶体：成熟的自噬体通过微管马达蛋白（如 dynein）向溶酶体移动 → 通过自噬体外膜STX17与溶酶体膜上的 VAMP8 及胞质中的 SNAP29 结合对接组成SNARE 复合物 → SNARE蛋白介导两者膜融合，形成自噬溶酶体（终体） → 溶酶体中的酸性水解酶（如组织蛋白酶 B/D/L）进入自噬溶酶体，降解内层膜及包裹的底物（如氨基酸、脂肪酸）→ 降解产物通过溶酶体膜上的转运蛋白（如 SLC15A4）释放到胞质，供细胞再利用。

（7）负反馈循环：在营养充足时，被回收的氨基酸重新激活，抑制自噬，形成一个负反馈循环。

【特殊标识：PI3P（成核信号）、LC3-II（膜延伸标志）、SNARE 复合物（融合关键）、Lamp-2（溶酶体膜标志蛋白）】

【最终归途：PI3P去磷酸化失去活性，等下一次激活；ULK1复合物失活解离、ATG12-ATG5-ATG16L1 四聚体解离回收、ATG12-ATG5-ATG16L1复合物解离回收、LC3-II分解变回LC3-I入胞质重复使用、TG9A蛋白本身会在自噬体闭合前被提取出来，通过囊泡运输再次回到反式高尔基体网络或内体中，重新装载膜脂，为下一轮自噬做准备。】

哺乳动物细胞中自噬体形成与关键组分Atg蛋白作用

Atg分子-酵母和哺乳动物细胞

4. 标志物

一、大自噬

大自噬形成过程：

3步：1-内质网和高尔基体等形成环状结构，包裹胞内结构形成双层膜囊泡结构，即自噬体；2-然后自噬体与溶酶体融合；3-自噬体内蛋白或者细胞器在溶酶体内被溶酶体酶讲解。（三类标志物：囊泡形成过程的标志物、溶酶体标志物、自噬底物标志物）

大自噬标志物：

I. 囊泡形成过程的标志物:

（1） Atg12-Atg5复合物---WB检测：Atg12--15 kDa；Atg5--32 kD；复合体--55 kDa；

（2）Atg16L1--Atg12-Atg5- Atg16L1复合物，不过自噬体形成后就离开了；检测早期自噬体的形成-方法：进行免疫透射电镜和免疫染色的检测；

（3）LC3参与了自噬体膜的形成，包括相互转化的形式即LC3-I和LC3-II（细胞内新合成的LC3经过加工, 成为胞浆可溶形式的LC3-I, 后者经泛素化加工修饰, 与自噬体膜表面的PE结合, 成为膜结合形式的LC3-II。LC3-II定位于前自噬体和自噬体, 是自噬体的标志分子, 随自噬体膜的增多而增加）；检测方法--WB ： LC3-I 18 kDa, LC3-II 16 kDa；（尽管PE偶联形式的LC3-II的分子质量较LC3-I大, 但是其具有强疏水性, 因此在SDS-PAGE中电泳迁移率反而比LC3-I (非PE偶联的LC3) 快，可以通过Western blot比较组间LC3-II水平, 也可通过计算LC3-II/LC3-I的比值来评价LC3-II水平, 并推测自噬囊泡数量的多少。）注意：LC3在含SDS的样品裂解液中易降解, 因此样品经煮沸裂解后应当尽快进行Western blot实验,并避免反复冻融。

（4）Atg9/mAtg9 --Atg蛋白中唯一的跨膜蛋白；哺乳动物细胞的为mAtg9，在形成成熟自噬体后, mAtg9并未整合进自噬体囊泡上, 而是又游离进入胞浆；用来检测为自噬的发生。

（5）Atg6/Beclin1：用荧光显微镜或透射电镜可检测Beclin1-GFP的点状聚集或斑块作为自噬标志物

II. 溶酶体标志物：一般为溶酶体膜蛋白：溶酶体相关膜蛋白1 (lysosome-associated membrane protein type 1, LAMP- 1)、LAMP-2和溶酶体整合膜蛋白 (lysosomal integral membrane protein, LIMP-2)--检测方法：可用免疫组化或Western blot的方法检测溶酶体重要膜蛋白的水平, 并与其他自噬相关蛋白结合使用。

III. 自噬底物标志物：p62也被称为SQSTM1, 在多种细胞和组织中都有表达, 可作为一个货车蛋白参与多种信号转导过程。p62可连接LC3和泛素化的底物, 随后被整合到自噬体中, 并在自噬溶酶体中被降解；当自噬被激活时自噬体与溶酶体融合, 自噬囊泡中p62等蛋白或细胞器被溶酶体酶降解, p62水平降低; 当自噬被抑制时自噬体积累, p62水平升高。因此, 可以用Western blot方法检测p62的水平, 作为自噬能力变化的指征。

二、分子伴侣介导的自噬（CMA）的标志物：CMA是胞浆内某些蛋白质被分子伴侣如热休克蛋白质70 (heat shock cognate protein of 70 kDa, HSC70) 识别, 并将其运送到溶酶体膜上, 再经溶酶体膜蛋白LAMP-2a结合后被转运到溶酶体腔中被溶酶体酶消化的过程，与大自噬和小自噬相比, CMA的主要特点是细胞质内的蛋白质直接经溶酶体膜蛋白转运入溶酶体腔, 不需形成自噬囊泡。（1）HSC70 70 kDa的热休克同源蛋白, 它是分子伴侣, 在胞浆识别带有KFERQ样序列的CMA底物；（2） LAMP-2a CMA的速率直接依赖于溶酶体膜上LAMP-2a的含量，LAMP-2a在胞内的水平可由于转录水平改变或降解速率改变而发生变化。抑制LAMP-2a将引起CMA底物GAPDH的聚集; 过表达LAMP-2a, 则引起GAPDH水平下降。

三、线粒体自噬标志物

线粒体自噬指在ROS、营养缺乏和细胞衰老等内外环境的刺激下, 细胞内的线粒体发生去极化, 而这些被损伤的线粒体将被特异性地包裹进自噬体中并与溶酶体融合, 从而完成损伤线粒体的降解, 维持细胞内环境稳定的过程。

流程：损伤的线粒体在发生线粒体自噬之前先发生动力相关蛋白1 (dynamin-related protein 1, DRP1) 介导的线粒体分裂。线粒体膜电位的下降引起PTEN诱导假定激酶 (phosphatase and tensin homolog-induced putative kinase 1, PINK1) 的聚集, 接着招募E3泛素连接酶Parkin到线粒体。Parkin促进线粒体膜上蛋白质泛素化, p62蛋白与线粒体上泛素化蛋白相互作用, 借助p62与LC3的互作引导线粒体被自噬体包裹。同时, 线粒体上存在自噬受体如BNIP3 (Bcl-2 and adenovirus E1B 19-kD interacting protein 3) 和NIX/ BNIP3L (BNIP3-like) 也可以与LC3互作使得受损线粒体通过自噬方式被去除。通常用线粒体标志物和自噬标志物LC3共定位来显示线粒体自噬。此外, 还有几个线粒体自噬受体也可以考虑用作线粒体自噬的标志。

（1）Atg32是一个分子质量约59 kDa的跨膜蛋白, 定位在线粒体外膜上；

（2）BNIP3和NIX BNIP3和NIX序列上有56% 的同源度, 且都有BH3结构域, 并与Bcl-2作用。

伴侣蛋白介导的自噬过程及其标志物

分子标记：如下图（ATG5，LC3）

LC3： Atg8/微管相关蛋白1轻链3 (microtubule- associated protein1 light chain 3, LC3)

Molecular markers of autophagy-2016年

5. 常见模型与诱导方式：

常见模型与诱导方式（Ai）

自噬在不同器官的生理功能与相关疾病

6. Reference：

http://html.rhhz.net/YXXB/html/20160106.htm

LiX,HeS,MaB.Autophagyandautophagy-relatedproteinsincancer.MolCancer.2020Jan22;19(1):12.doi:10.1186/s12943-020-1138-4IF:33.9Q1.PMID:31969156;PMCID:PMC6975070.

OhsumiY.Historicallandmarksofautophagyresearch.CellRes.2014Jan;24(1):9-23.doi:10.1038/cr.2013.169.Epub2013Dec24.PMID:24366340;PMCID:PMC3879711.

MizushimaN,KomatsuM.Autophagy:renovationofcellsandtissues.Cell.2011Nov11;147(4):728-41.doi:10.1016/j.cell.2011.10.026.PMID:22078875.