本文选自hepatology， doi:10.1136/gutjnl-2018-317257，喜欢的朋友可以自行下载阅读。
本文有肝癌的免疫治疗出发，首先介绍了肝癌免疫抑制微环境导致淋巴细胞浸润减少，从而免疫检查点治疗效果欠佳，那么，这种免疫抑制微环境是如何变化的，针对这种免疫抑制微环境的改变始动因素予以干预，会不会得到更好的临床预后呢？作者就此问题进行了深入探讨。
因为肝癌形成三部曲，肝炎-肝硬化--肝癌，肝硬化在肝癌形成中非常重要，作者首先诱导了鼠肝硬化，用流式细胞术评价MDSCs的功能意义，并通过临床标本进行验证。在人肝星状细胞(HSC)-外周血单个核细胞培养体系和肝纤维化-肝癌患者来源的MDSCs中进行了机制研究。从此可以看出，这里作者想要做的就是MDSC和HSC之间的CROSS-TALK,这种crosstalk导致了肿瘤淋巴细胞浸润减少，因为现在免疫治疗的靶点CTAL4或者PD-L1其实都是淋巴细胞的靶点，特别是T淋巴细胞（细胞毒性T细胞），很多肿瘤免疫治疗效果差的原因之一就是因为肿瘤浸润的淋巴细胞太少，不能起到临床细胞杀伤效应，或者肿瘤分泌免疫靶向的受体结合药物，导致药物效价降低，或者分泌外泌体充当DECOY功能。
作者发现单核细胞MDSCs(M-MDSCs)在纤维化肝脏中的积聚，而非多形核MDSCs，与肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的减少和肿瘤致瘤性的增加显著相关，在人肝癌组织中也存在相似的作用。在机制上激活的HSCs诱导单核细胞固有的p38MAPK信号，以触发增强子重新编程，以促进M-MDSC的发展和免疫抑制（话说我他妈不就是在干这个，以前想过通过诱导肝纤维化，能否促进A肿瘤的转移，从而决定肝纤维化在A肿瘤肝转移中的作用，通过A分泌的B物质促进肝纤维化，说明A可以促进肝纤维化微环境从而促进肿瘤转移作用，在人肝转移组织中进行验证，临床-模型双对照，证明自己的假设）。
好了，看正文吧。上图。
给大家一个造血干细胞的谱系图，好理解爸爸到底去哪了。
文章上来作者先造肝硬化模型，C57小鼠用了不同的诱导剂（橄榄油和四氯化碳），造模成功后接种肝癌细胞至肝上，小鼠肝癌在CCl4诱导的纤维化肝脏中的生长速度比注射橄榄油的对照组快得多，表现为肿瘤荧光素酶强度和肿瘤重量的增加。我觉得以后灶转移瘤模型是不是也可以直接肝内注射。
也就是间接说明了肝纤维化严重的可能更适合肝癌生长，因为纤维化是HSC造成的，所以HSC活化的越明显，对肝癌生长的促进越显著。（盲猜作者下面只会用CCL4了），因为作者为了研究免疫抑制微环境变化，所以说呢，下面该看看作者想看的这个细胞MDSC怎么样了。测量了CD11b+Ly6G-Ly6C+ M-MDSCs和CD11b+Ly6G+Ly6Cint- PMN-MDSCs的水平，它们有助于免疫抑制肿瘤微环境。观察到M-MDSCs显著增加(p<0.05；)，但PMN-MDSCs没有增加。作者发现M-MDSCs水平可能与肝纤维化程度有关，肝浸润的M-MDSC比例（并非肿瘤浸润的M-MDSC）也与肿瘤质量有关。（可怕的事情还是发生了）
经CCl_4处理的小鼠肿瘤浸润的CD8+T细胞比例明显低于对照组(p<0.6035)，且与肿瘤质量呈负相关(r2=0.6035，p<0.0001；)。重要的是，肝脏浸润的M-MDSC比例与肿瘤浸润的CD8+T细胞呈负相关。T细胞的表面标记物可真TM多啊，该怎么选呢？会不会不同亚型的T细胞也不同，那要做流式岂不是都要买了试一遍。
作者进一步又在脂肪性和非酒精性肝炎肝纤维化鼠中观察了上述结果，得到一致结论，也就是说，促进肿瘤生长效应其实是肝纤维化的一个结果。也是为了揭示一个普遍现象的结果，并非是不同药物诱导所引起的结果。（逻辑好严谨啊）
作者进一步在人的标本中看看纤维化水平和M-MDSC的水平，通过测量有潜在纤维化/肝硬化的肝癌患者(n=24)和没有潜在纤维化/肝硬化的患者(n=7)的肝脏和肿瘤浸润水平来研究M-MDSC的临床相关性。M-MDSCs在肝脏中的表达水平明显高于肿瘤，在一个HCC组织芯片中进行了CD33免疫组织化学染色，其中包括197例有记录的临床随访数据。KaplanMeier分析显示，CD33在肝脏高表达，临床病理相关分析显示，CD33在肝脏中的高表达，而在肿瘤中的高表达，与较大的肿瘤大小、增加的血管浸润和肿瘤分期显著相关。多变量分析进一步显示，肝脏CD33的高表达与较差的患者存活率呈正相关。
然后下面作者又探讨了HSC和M-MDSC的crosstalk。作者用人的外周血提取了单个核细胞，然后把人的LX2的CM搁里头培养.在这个培养体系中，M-MDSCs被特异性地诱导出来,其表型与从肝纤维化相关肝癌患者中分离出来的细胞相似。
与患者来源的M-MDSCs相似，造血干细胞诱导的M-MDSCs也显著抑制T细胞的增殖。
对分选的HSC诱导的M-MDSCs和未经处理的CD14+单核细胞进行RNA测序(RNA-seq)分析，发现869个差异表达基因。这些基因在关键信号通路中显著富集，但MAPK信号转导的作用尚不清楚，与CD14+单核细胞相比，在HSC诱导的M-MDSCs中，MAPK级联中的多个基因明显上调。磷酸化p38 Thr180/Tyr182(p-p38Thr180/Tyr182)的Western印迹分析进一步证实了HSC诱导的M-MDSCs中p38 MAPK的强烈激活。
细胞细胞之间的crosstalk需要信号转到，那么怎么转到的呢？接下来通过一种特定的抑制剂SB203580研究了p38MAPK信号对M-MDSC基因表达的影响。与人CD14+单核细胞相比，造血干细胞诱导的M-MDSCs高表达髓系决定转录因子CCAAT-增强子结合蛋白β(C/EBP1436)，该蛋白可被SB203580处理后取消。S100家族成员，特别是高表达的S100A8、S100A9和S100A12也同时受到p38MAPK信号的调节。造血干细胞刺激的p38MAPK信号通路通过诱导C/EBPβ介导的染色质调节，对M-MDSC的聚集和功能起关键作用。作者首次发现C/EBPmRNA的敲除降低了S100A8/9/12的表达(p<0.05)和M-mdsc比例(p<0.05)。接下来显示，在造血干细胞诱导的M-MDSCs中，p38MAPK信号调节C/EBPmRNA的表达，并与其自身和S100A8/9/12启动子结合。作为C/eBPβ的真正共激活因子，p300依赖的转录被p38MAPK介导的组蛋白3丝氨酸28(H3S28ph)的磷酸化所增强。事实上，C/eBPβ和S100A8/9/12启动子在H3S28ph和p300的启动子占有率也同时受到p38MAPK信号的调节。为了进一步确定其功能意义，用SB203580处理人外周血单个核细胞培养体系，发现p38MAPK抑制显著地抑制了造血干细胞诱导的M-MDSC的增殖(p<0.001，并削弱了T细胞的抑制活性。
文中猝不及防的突出了S100家族，差点闪到腰，其实这是一种炎性介质，很多种细胞都会分泌，属于分泌蛋白，可以刺激HSC纤维化的作用，有利于形成炎性环境。我似乎发现了什么。为了研究体内p38MAPK信号的作用，用临床试验的p38MAPK抑制剂GW856553治疗C57BL/6小鼠，或在CCl4诱导纤维化期间和随后的肿瘤细胞移植期间用赋形剂对照，给予GW856553显著抑制纤维诱导的M-MDSC扩张(p<0.01)和肿瘤生长，导致肝癌成瘤性显著降低(p<0.05。值得注意的是，GW856553还显著降低了肝脏浸润性M-MDSC的比例，其与肿瘤质量和肿瘤浸润性CD_8+T细胞比例(R2=0.5683，P<0.0001)分别呈正相关和负相关。一般药物操作，之后开头实验的重复，但是能说明问题啊。
在肿瘤细胞植入后给予GW856553并没有降低HCC的致瘤性，说明纤维化形成后可以形成促肿瘤形成的结果，在GW856553治疗的小鼠中，一些肿瘤甚至比未治疗的小鼠更大，这与p38MAPK的肿瘤抑制作用是一致的（什么时候提到的）。事实上，通过RNA干扰抑制肿瘤细胞固有的p38MAPK显著增加了肿瘤的致瘤性(p<0.001；)。总之，这些数据表明髓系固有的p38MAPK信号对HCC的生长至关重要。
接下来，作者检测到纤维化HCC患者循环CD14+单核细胞中p-p38Thr180/Tyr182的水平明显高于健康供者(p<0.05；)，支持我们的研究结果的临床相关性。此外，GW856553处理肝癌患者外周血单个核细胞后，CD14+HLA-DR−/low MMDSC比例明显降低(p<0.001)，而HLA-DR和共刺激分子(CD40、CD80和CD86)的表达明显增加(p<0.05)，表明单核细胞成熟。
表明在纤维化的肝环境中，p38MAPK的激活在功能上将HSC诱导的M-MDSC聚集与抑制抗肿瘤免疫监视联系在一起。p38MAPK介导的增强子重编程决定了M-MDSC的身份和免疫抑制。
鉴于p300在转录增强子的激活中的重要性和免疫细胞中增强子调节的新角色，作者接下来研究了M-MDSC中依赖于p300的增强子活性。首先，在HSC介导的M-MDSCs诱导过程中，增强子活性的组蛋白标记，组蛋白H3赖氨酸27乙酰化(H3K27ac)整体增加。此外，特定的p300抑制剂C646可剂量依赖性地降低H3K27ac水平。值得注意的是，HSC诱导的M-MDSC可被C646取消(p<0.01；)，强调了p300介导的H3K27ac在M-MDSC聚集中的重要性。扫盲了：组蛋白在DNA转录过程中其实意义重大，组蛋白研究最多的就是这个H3，因为其非常保守，而且他27位点的甲基化会抑制转录，乙酰化或者磷酸化会增强转录功能（最近在看细胞生物学学到的）。
转录增强子是关键的调控元件，由谱系决定的转录因子、共激活因子以及溴域和端外结构域(BET)家族蛋白的组合组装驱动，包括BRD4，它将转录复合物招募到H3K27ac上进行增强子RNA(ERNA)合成。利用rna-seq数据，作者发现了与FANTOM5增强子重叠的非编码RNA，包括针对C/EBPRNA和S100A8/9/β的RNA。通过RT-qPCR，验证了这些eRNAs在HSC诱导的M-MDSCs中与CD14+单核细胞相比过表达。C/eBPβ和S100A8/9/12增强子被C/eBPβ、p300、H3K27ac和BRD4富集。此外，SB203580或C646处理取消了它们在HSC诱导的M-MDSCs中的增强子结合，这与p38MAPK信号的关键作用及其与p300的相互作用是一致的。
为了进一步研究增强子调控在M-MDSC中的意义，作者用BET抑制剂JQ1处理人PBMC培养系统。与C/eBPβ和BRD4的增强子共调控功能一致，JQ1同时阻断了它们对C/eBPβ和S100A8/9/12增强子的招募，导致靶基因表达的显著抑制。重要的是，JQ1治疗显著降低了造血干细胞诱导的M-MDSC的扩增(p<0.001.)和T细胞抑制活性(p<0.01)，并伴随着成熟标志物的上调(p<0.05)。总体而言，这些结果表明p38MAPK传导外在信号以增强M-MDSC积累和功能的启动子重编程。
作者通过使用小分子BET抑制剂I-BET762(也称为GSK525762)(目前正在进行I/II期临床试验(NCT02964507/NCT03150056))治疗纤维化HCC患者来源的PBMC，研究了BET抑制的临床潜力。与赋形剂对照组相比，I-BET762处理组小鼠CD_(14)+HLA-DR−/low M-MDSC比例显著降低(p<0.001)。S100A8/9/12蛋白在M-MDSCs中的表达也显著降低(p<0.05；)，而成熟标志物表达明显上调(p<0.05；)。这些发现证明了肝癌患者来源的M-MDSCs对BET抑制的敏感性。
作者做到这里我觉得因该做的差不多了，至少说明了这个免疫抑制功能的形成，虽然不知道HSC在这个过程到底起了什么作用，这不也给我们留下了点可以研究的东西吗？我似乎又有了点想法。打质谱，提外泌体测序，总会发现点什么玩意儿。
最后，作者又拐上免疫治疗这个主题了。BET溴域抑制增强PD-L1阻断疗效，根除肝癌并延长生存期。然后抑制MMDSC的形成以及促进T淋巴细胞的浸润。也就是上面作者所说的所有的一个总结。
好文到此结束，总结一下文章的特点，大量的动物实验，细胞实验很少，紧密结合临床，无论是动物还是细胞实验都用临床样本进行对照，其实机制上并不深，结合了测序技术和生信分析，蹭了当下的热点免疫治疗，总的来说，挺有借鉴意义，但是如果作者能更加明确阐述HSC对MDSC的分化直接影响就更好了。欢迎批评，指正。
