本期向大家介绍一篇在Molecular Cancer最新发布的关于三阴性乳腺癌中CircNR3C2通过海绵化miR-513a-3p促进HRD1介导的肿瘤抑制作用，文章题目：CircNR3C2 promotes HRD1-mediated tumor-suppressive effect via sponging miR513a-3p in triple-negative breast cancer，原文地址：10.1186/s12943-021-01321-x，影响因子：15.302，作者：苏东明教授（南京医科大学附属逸夫医院）。
乳腺癌常被称为“粉红杀手”，其发病率位居女性恶性肿瘤的首位，男性乳腺癌较为少见。乳腺癌根据基因表达模型不同主要分为四个不同的分子亚型，其中三阴性亚型乳腺癌被报道最多的一种亚型。原发性肿瘤的转移和复发是导致死亡的主要原因，上皮间充质细胞转移是乳腺癌扩散过程中的一个重要环节，在扩散的过程中，波形蛋白的表达显著升高，表明了波形蛋白在癌细胞转移过程中起到重要的作用，其中翻译后修饰，如磷酸化、乙酰化以及泛素化都会影响波形蛋白结构和功能的稳定性。最新研究报道称E3泛素连接酶TRIM56和RNF208通过诱导波形蛋白的多泛素化介导蛋白酶体降解，分别减少卵巢癌和乳腺癌细胞的迁移和侵袭。本文作者也发现了一种E3泛素连接酶HRD1通过相关作用来减少乳腺癌细胞的迁移和侵袭，作者通过本文阐述E3泛素连接酶HRD1如何通过相关作用机制来对肿瘤的抑制作用。
结果展示
❶ HRD1在三阴性乳腺癌组织和乳腺癌细胞系中显著低表达
作者为了探讨HRD1在不同乳腺癌亚型中的表达模式，用一些临床样本组织和相关癌细胞，运用了Immunoblotting、immunohistochemical staining 和 RT-qPCR研究方法，结果表明：相对于乳腺癌其他三种亚型组织样本和细胞样本，HRD1在三阴性乳腺癌中的表达水平显著低于其他几种亚型乳腺癌（如图下图A-I），初步说明了HRD1在三阴性乳腺癌中起到至关重要的蛋白分子。
❷ HRD1表达与波形蛋白（Vimentin）表达负相关
相关报道HRD1是一种E3泛素连接酶，以及一种在乳腺癌中起到至关重要的蛋白分子- Vimentin，作者为了研究HRD1的功能以及和Vimentin之间的作用机制，构建了过表达HRD1载体，瞬转到MDA-MB-231乳腺癌细胞系中，结果发现，过表达HRD1组中，Vimentin的蛋白表达水平显著降低于对照组。作者还通过收集60例临床组织样本，通过免疫组化观察两种蛋白分子的表达情况，结果表明两种蛋白的表达水平呈负相关（如下图A-F）。
❸ 波形蛋白的降解需要HRD1泛素化作用
根据结果2，作者大胆猜测HRD1可能通过泛素化机制对波形蛋白起到降解作用。为了证实这种猜测，选MDA-MB-231和BT549两种细胞，过表达HRD1，免疫印迹分析结果表明，波形蛋白在两种细胞中的表达水平显著减少，同时也观察细胞中其他的上皮细胞-间充质转化标记蛋白的表达量没有发生变化。用环己酰亚胺处理细胞后进行WB，结果表明HRD1主要是通过蛋白酶对波形蛋白起到快速降解作用。作者还通过免疫共沉淀、免疫荧光染色以及Co-IP试验方法证实了HRD1和波形蛋白存在着相互结合作用。此外，基于泛素化发生在目标蛋白的赖氨酸残基这个事实，作者在波形蛋白的头部结构域中鉴定出一个赖氨酸残基，为了检查该残基对HRD1介导的波形蛋白的泛素化是否至关重要，通过用丙氨酸替代在不同物种中进化保守的赖氨酸残基生成波形蛋白突变体，当野生型波形蛋白通过HRD1进行多泛素化时，波形蛋白突变体并没有进行多泛素化（如下图A-K）。
❹ HRD1通过对波形蛋白降解起到抑制肿瘤形成和上皮介质转化
作者继续探讨HRD1通过对波形蛋白降解起到抑制肿瘤形成的机制。作者通过CCK8和单克隆形成实验证实过表达HRD1能够抑制细胞增殖和分化，相反同时过表达波形蛋白能挽救这种现象。作者还进行了在相关三阴性乳腺癌中过表达HRD1，细胞的迁移能力和侵袭能力都显著减弱，划痕实验也验证了细胞的侵入能力显著下降（如下图A-K）。
❺ CircNR3C2和miR-513a-3p被预测起到调控HRD1的作用
作者为了找到和HRD1相关的circRNA和miRNA分子，在GEO数据库上下载关于乳腺癌的临床信息，应用生物信息学手段找到和HRD1相关TOP 10的circRNA，作者接下来通过GO和KEGG的富集分析，也找到了和HRD1作用相关的miRNA，最后通过在线网址预测能相互作用的circRNA和miRNA，确定了circNR3C2和miR-513a-3p作为后续研究分子（如下图A-I）。
❻ CircNR3C2在三阴性乳腺癌显著下调
CircNR3C2核酸序列全长1760bp，由基因NR3C2第二个外显子剪接而形成。分别提取三阴性乳腺癌组织样和其他亚型乳腺癌组织样RNA，QPCR结果表明：相对于其他亚型乳腺癌组，CircNR3C2和HRD1在三阴性乳腺癌组织中的mRNA表达水平显著降低。通过FISH实验证实了CircNR3C2存在细胞质中（如下图A-H）。
❼ 过表达circNR3C2通过海绵吸附miR-513a-3p促进HRD1上调
通过生物信息学分析结果可知circNR3C2和miR-513a-3p相互作用能调控HRD1在乳腺癌中的表达。通过在MDA-MB-231细胞瞬转miR-513a-3p mimic或者inhibitor，应用免疫印迹和RT-PCR方法检测细胞中HRD1蛋白和mRNA表达水平显著减少（mimic）或者增多（inhibitor）。作者为了验证miR-513a-3p和HRD1的作用关系，设计了与miR-513a-3p结合位点突变的HRD1序列和正常结合位点序列分别进行荧光素酶报告实验，结果显示，转染miR-513a-3p mimic或者inhibitor可以显著减少或者增加荧光强度。同时，过表达circNR3C2同样能增加HRD1的mRNA表达水平或者蛋白表达水平但是不能显著减少miR-513a-3p的mRNA水平。作者通过RNA pull down实验证实了circNR3C2和miR-513a-3p相互结合位点，同样设计了突变型和野生型circNR3C2双荧光素酶质粒进行荧光素酶报告实验，结果表明miR-513a-3p inhibitor能显著减少荧光强度。所以通过以上的一系列结果说明circNR3C2、miR-513a-3p和HRD1的相互关系能够影响乳腺癌的发生。
❽ 通过过表达circNR3C2引起波形蛋白的降解从而抑制肿瘤的生长和转移
根据以上的结果，作者猜测过表达circNR3C2能够影响波形蛋白在三阴性乳腺癌细胞的稳定性。通过在三阴性乳腺癌细胞中过表达circNR3C2，观察波形蛋白的mRNA表达水平和蛋白表达水平，结果表明，相对于对照组过表达circNR3C2能够促进波形蛋白的翻译水平提高，而mRNA表达水平没有明显变化。在细胞功能验证中，作者通过CCK8和克隆形成实验来研究过表达circNR3C2对细胞增殖的影响，以及通过划痕实验和侵袭实验研究过表达circNR3C2对细胞侵袭的影响，结果表明过表达circNR3C2能够抑制细胞的增殖和侵袭能力降低。最后，作者建立了一个体内肿瘤转移模型，讲用不同处理的MDA-MB-231细胞尾静脉注射免疫缺陷裸鼠体内，过表达circNR3C2组肺转移和转移性肺结节显著减少（如下图A-I）。
总结
本文作者阐明了一种新的肿瘤抑制因子HGD1通过诱导多泛素化介导波形蛋白的蛋白酶体降解，作用机制主要是通过circNR3C2海绵吸附miR-513a-3p促进HRD1上调，从而起到对波形蛋白的蛋白酶体降解作用，最终抑制三阴性乳腺癌的增殖和转移。
