做RNA-seq可以比较不同样本之间基因表达水平的差异，那么如何衡量基因的表达水平呢？
最简单的方法是，直接比较mapping到某一个基因的reads数目。但是这种做法有不足：
基因长度差异引起误差：如果一个gene1的外显子长度是gene2的10倍，在某组织内两个基因同样产生一个转录本，建库测序后mapping到gene1的reads数远高于gene2，造成了误差。
测序深度引起误差：相同材料分两份同时建库，假设材料1公司返回数据包含100w条reads，材料2公司返回数据包含200w条reads，mapping到同样一个基因的reads数，材料2大概是材料1的两倍。
为此，通用的做法是用外显子长度和reads总数目来校正，以下是几个衡量表达量的单位：
1.RPKM（主要针对单端测序）
RPKM= total exon reads/ (mapped reads (Millions) * exon length(KB))
mapping到gene1外显子的reads/（mapping到基因组的reads数目*gene1外显子长度）
2.FPKM（主要针对双端测序）
fragments的概念：pair-end reads两个reads都比对上，这一对reads算一个fragment；只有其中一个reads比对上，比对上的reads算一个fragment，所以2*fragments数>reads数
FPKM= total exon fragments/ (mapped reads (Millions) * exon length(KB))
mapping到gene1外显子的fragments/（mapping到基因组的reads数目*gene1外显子长度）
3.TPM
TPMi = ( Ni/Li )*1000000 / Σ Nj/Lj
Ni是mapping到genei的reads数，Li是genei的外显子长度。TPM的定量思路是，每一个检测到表达的gene都用外显子长度进行校正，然后看某一个gene所占的比例。我们其实可以发现，其实TPM就是FPKM值的百分比，参考（http://www.bio-info-trainee.com/2017.html）
做RNA-seq，我们会得到一个纵轴是gene，横轴是样品的表达矩阵，如果用RPKM/FPKM定量，材料i所有基因的表达量之和与材料j的不一定相同（表达矩阵的两列），不适合材料之间的比较，可用于同一材料比较不同基因的表达水平；用TPM定量，任意材料所有基因的表达量之和都是1，可用于比较不同材料间的基因表达。
