2020-03-31 10x单细胞学习1

1. 单细胞转录组测序（scRNA-seq）基础知识

单细胞转录组测序（scRNA-seq）是指通过对单个细胞mRNA进行高通量测序，获得相应数据并进行信息分析的技术

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分离技术（有多种）—微流控通过微米级别的流道精准操控微升、毫升级别样品的技术，包括液滴技术（10X）

2. 10X Genomics scRNA-seq 基础知识

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10X Genomics技术原理

通过利用微流体“双十字交叉系统”，获得GEM（Gel Bead in Emulsion）,收集GEMs后，微磁珠释放Barcoded标记每个细胞，随后构建文库进行测序。

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GEM（Gel Bead in Emulsion）是指油滴包裹的，含有Barcode的Gel Beads和细胞、反应试剂的混合物。
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微磁珠（Gel bead）
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每个Gelbead的10Xbarcode均不同，形成GEM后用于区分细胞
UMI区分统一细胞的不同转录本并去除PCR Duplication，实现绝对定量

技术流程

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细胞裂解


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反转录


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cDNA扩增
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纯化
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酶切、末端修复、加A、连接


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实验流程

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样本要求

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单细胞悬液要求（使用酶消化）

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具体可参考样本制备手册，有详细protocol
洗涤和重悬溶液
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或使用培养基、PBS
清洗一次即可，建议使用宽枪头

细胞过滤

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细胞活力

使用细胞计数仪，保证1000cell/ul，检测细胞活力，去除死细胞

信息分析

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核心.png

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不同细胞不同颜色及分布


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对稀有细胞进行鉴定
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应用领域

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应用.png

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10X特点

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研究路线

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轨迹分析.png

高级分析

研究

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时间点需要找好


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smart-seq可以作为scRNA-seq的验证

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