导读

• 宏基因组分箱（Binning）是将宏基因组测序得到的混合了不同生物的序列或序列组装得到的contigs按物种分开归类的过程，类似下图[1]。传统的单物种全基因组序列都是经纯培养之后，再进行全基因组de novo测序才获得的，但是环境中存在着大量的不可培养微生物，宏基因组分箱技术有助于获得不可培养微生物的全基因组序列，获得新物种的基因组序列和功能，预测未知物种的培养方法等等。

  
  
  分箱.png

一、分箱工具盘点

• 早在2011年，science上的一篇文章就用了宏基因组Binning技术对来自牛瘤胃的样本进行了宏基因组测序研究。该研究从268 Gbp的宏基因数据中成功Binning出了15个不能培养的微生物的全基因组序列（可见分箱对数据量要求很大）。从那以后，宏基因组Binning技术开始被更多的人关注和重视，也逐渐出现了很多宏基因组Binning工具。查了一些文献和资料，我罗列了一下近几年的分箱工具，引用量仅供参考（google学术，2019.8.29）。

二、分箱工具比较

1. 2017年Nature Methods上一篇文章对宏基因组数据处理各个过程中的软件进行了评估[ Critical Assessment of Metagenome Interpretation-a benchmark of metagenomics software ]。从文章的分析结果来看，不同的方法各有优缺（下图），MaxBin2可能是相对较好的一个分箱软件。

• 比较结果：

  
  
  NM.png

2. 加利福利亚大学在通过整合多个算法设计出了新的Binning软件DAS tool并在2018年发表在Nature Microbiology上 [ Recovery of genomes from metagenomes via a dereplication, aggregation and scoring strategy ]。集合了多个算法的DAS tool各项Binning指数要明显优于CONCOCT，MaxBin 2，MetaBAT等方法，比较分析结果如下：

• 比较结果：

  
  
  对不同样本来源的宏基因组数据进行分箱完成度分析.png
  
  
  对模拟微生物群落进行基因组重建分析.png

3. 同年，Microbiome上发表了另一个整合了多个工具的分箱分析流程MetaWRAP [MetaWRAP—a flexible pipeline for genome-resolved metagenomic data analysis. Microbiome]。

• MetaWRAP流程不仅纳入了最流行的MetaBAT、CONCOCT和MaxBin2分箱方法，还整合了质控、拼接、分箱、提炼、评估、注释等多种功能。MetaWRAP可以解决分箱分析中可能遇到的绝大多数问题，而且比较分析发现综合多个工具的MetaWRAP分箱法不仅比单个工具分箱效果好，也比同样是综合多个算法的DAS tool分箱法效果好，比较分析结果如下：

• 比较结果：

  
  
  完成度和污染度的比较（CAMI数据集）.png
  
  
  完成度和污染度的比较（水、肠道、土壤数据）.png
  
  
  metaWRAP重组装分箱效果更佳.png

三、分箱实战

• MetaWRAP集合的算法和工具很全很多，但是也很慢，有条件的话可以自己尝试使用MetaWRAP。[Extensive Unexplored Human Microbiome Diversity Revealed by Over 150,000 Genomes from Metagenomes Spanning Age, Geography, and Lifestyle. Cell. 2019]这篇文章提到，MetaBAT2在单样本分箱中表现最佳，也在Metawrap文章中表现不错。Metawrap看似有前途，但是存在两个缺点：1）没有独立验证；2）计算成本高。考虑到时间，下面只以MetaBAT2为例简介分箱工作流程。

1. 准备

• 下面是需要的软件和数据：

• MetaBAT2分箱工具地址：
  https://bitbucket.org/berkeleylab/metabat/src/master/

• CheckM分箱质检地址：
  https://github.com/Ecogenomics/CheckM/wiki

• MetaBAT2测试数据地址：
  https://portal.nersc.gov/dna/RD/Metagenome_RD/MetaBAT/Software/Mockup/

测试数据.png

• 下载得到已经组装好的contigs文件assembly.fa和两个样本的bam文件。

2. 统计contig深度

jgi_summarize_bam_contig_depths --outputDepth depth_var.txt *.bam

• 统计结果：

  
  
  contigs深度.png

• 结果说明：
  第一列：contigName
  第二列：contigLen
  第三列：totalAvgDepth
  第四列：library1.sorted.bam
  第五列：library1.sorted.bam-var
  第六列：library2.sorted.bam
  第七列：library2.sorted.bam-var

3. 分箱(4线程，21秒)

time metabat2 -t 4 -i assembly.fa -a depth_var.txt -o metabat2/bin –v

• 分箱结果：

  
  
  分箱结果.png

4. 分箱评估 (4线程，32分钟)

time checkm lineage_wf -f metabat2/checkm.txt -t 4 -x fa metabat2/ metabat2/checkm/
##  评估结果保存在checkm.txt文件中。

5. 评估结果：

• 提取ID，Taxonomy，Completeness，Contamination信息：

grep 'bin' checkm.txt | sed 's/^  //' | awk '{print $1,$2,$13,$14}' | sed 's/\ /\t/g'| sed 's/\./\t/' | sort -n -k 2 | sed 's/\t/./' > test.txt
##  从checkm.txt提取

• 提取结果：

  
  
  分箱评估结果.png

第一列：Bin Id
第二列：Marker lineage
第三列：Completeness
第四列：Contamination

结束语

• 到此就完成了两个样本的宏基因组分箱和分箱评估工作。这只是宏基因组分箱的简介，更全更详细的分箱分析可以参考MetaWRAP分析流程。

• MetaWRAP分析流程地址：
  https://github.com/bxlab/metaWRAP/blob/master/Usage_tutorial.md

metawrap concoct报错

/public/home/zzumgg03/huty/softwares/miniconda3/envs/metawrap-env/bin/concoct_coverage_table.py:48: FutureWarning: read_table is deprecated, use read_csv instead, passing sep='\t'.
  df = pd.read_table(fh, header=None)
Traceback (most recent call last):
  File "/public/home/zzumgg03/huty/softwares/miniconda3/envs/metawrap-env/bin/concoct_coverage_table.py", line 77, in <module>
    generate_input_table(args.bedfile, args.bamfiles, samplenames=samplenames)
  File "/public/home/zzumgg03/huty/softwares/miniconda3/envs/metawrap-env/bin/concoct_coverage_table.py", line 52, in generate_input_table
    avg_coverage_depth.to_csv(sys.stdout, index_label='contig', sep='\t', float_format='%.3f')
  File "/public/home/zzumgg03/huty/softwares/miniconda3/envs/metawrap-env/lib/python2.7/site-packages/pandas/core/generic.py", line 3007, in to_csv
    from pandas.io.formats.csvs import CSVFormatter
ImportError: cannot import name CSVFormatter

参考：

1. 句句干货！一文读懂宏基因组binning
2. Microbiome：宏基因组分箱流程MetaWRAP简介
3. 宏基因组分箱Binning以及MaxBin的使用
4. 分箱原理