影响因子：5.7
研究概述：肿瘤微环境（TME）由免疫细胞、肿瘤细胞、基质细胞。癌症相关成纤维细胞（CAF）是TME中发现的主要基质细胞，对肿瘤发生、进展、转移和治疗耐药的生物学特性具有重要影响。采用单细胞转录组学分析发现抗原呈递CAF（apCAF）是CAF的主要细胞亚群，近年来备受关注。在这项研究中，作者基于9种不同实体瘤的转录组数据，通过利用单细胞转录组学、空间转录组学等生物信息学分析，发现apCAFs存在于大部分的肿瘤中。并且，apCAFs与大多数实体瘤的抗肿瘤作用有关。其主要富集于与T细胞活化、抗原加工和呈递以及干扰素反应相关的免疫反应通路中。apCAFs可能主要来源于正常成纤维细胞，apCAFs可能与CD4+效应T细胞的激活有关，并可能通过C1Q分子的表达促进CD4+效应T细胞的存活。此外，apCAFs表现出转录因子RUNX3和IKZF1的高度富集，以及糖酵解代谢的增加。综上所述，这些发现为更深入地了解apCAFs以及apCAFs靶向免疫治疗癌症的潜在治疗意义提供了新的见解。
研究结果：
各种实体瘤类型中apCAF的鉴定
为了检查实体瘤微环境中是否存在apCAF，作者收集了9种常见实体瘤的scRNA-seq数据，包括头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）、卵巢癌（OV）、鼻咽癌（NPC）、宫颈癌（CC）、结直肠癌（CRC）、乳腺癌（BRCA）、肢端黑色素瘤（AM）、皮肤黑色素瘤（CM）和肾细胞癌（RCC）（如图1A）。所有实体瘤共包括210个样本，各组样本数如图1B所示。作者利用SeuratR包进行主成分分析和基于图的聚类分析方法，将单个细胞分类到不同的簇中。通过根据典型基因标志物的表达得到了9种主要类型细胞的转录组，然后使用UMAP算法来降维并将细胞在HNSCC中的分布进行可视化（如图1C）。典型基因标志物的表达情况如图1D所示。鉴于CAF在实体瘤中具有功能异质性，作者将CAF群体重新聚类为不同的亚群。共聚类为4种类型的CAFs亚群，分别为apCAFs、myCAFs、eCAFs和iCAFs（如图1E-F）。MHC II类分子、ACTA2/RGS5肌成纤维细胞分子、MMP14/LOXL2细胞外基质分子和炎症分子在上述四个亚群中分别特异性高表达（如图1F）。对于OV患者也使用同样的分析方法进行分析，共注释为7种类型的细胞（如图1G-H）。共聚类为4种CAFs亚群，分别为apCAFs、myCAFs、eCAFs和iCAFs，其主要特征分别为MHC II类分子、ACTA2/RGS5肌成纤维细胞分子、MMP14/POSTN细胞外基质分子和炎症分子的特异性高表达。除此之外，作者对其余7种实体瘤也按照上述方法进行了分析。在这9种实体瘤中，主要包括肿瘤细胞、免疫细胞和基质细胞这3种类型的细胞群，以及每种主要细胞类型的亚群，尤其是apCAFs。这些结果表明，apCAFs亚群通过与其他不同类型细胞进行交流，从而发挥关键作用。
apCAFs与抗肿瘤作用有关
已有研究报道，apCAF在PDAC中具有促肿瘤功能，在NSCLC中具有抗肿瘤功能。apCAF对肿瘤具有一定的影响，但是其具体的关系还未可知，所以，作者接下来对apCAF与肿瘤细胞之间的关系进行了研究。作者从TCGA数据库中获得了大量RNA-seq队列，包括TCGA-HNSC（头颈部鳞状细胞癌）、TCGA-OV（卵巢癌）、TCGA-CESC（宫颈鳞状细胞癌和宫颈内膜腺癌）、TCGA-COAD（结肠腺癌）、TCGA-READ（直肠腺癌）、TCGA-BRCA（乳腺浸润性癌）、TCGA-SKCM（皮肤皮肤黑色素瘤）和TCGA-KIRC（肾透明细胞癌）。以及GSE102349-NPC（鼻咽癌）队列。利用相同实体瘤类型的scRNA-seq数据和预先注释的细胞类型作为参考数据集，制作特征矩阵，应用CIBERSORTx算法对相同实体瘤类型的大量RNA-seq数据进行反卷积分析，获得RNA-seq数据中每个样品的特征评分。
作者基于TCGA-HNSC队列的临床数据对apCAF特征评分与患者生存期的相关性进行研究。结果显示，apCAF的特征评分高，HNSCC预后更好（如图2A)。此外，在TCGA-HNSC队列中，apCAFs特征评分与肿瘤细胞特征评分显著负相关。这表明apCAFs可能与抗HNSCC作用相关（如图2C）。将TCGA-OV样本进行同样的分析后发现，apCAFs特征评分高，预后良好。并且，apCAFs特征评分与肿瘤细胞特征评分之间也显著负相关（如图2B，D）。作者对其他肿瘤类型的队列也进行了相同分析，大部分研究结果趋势均与上述结果一致。这些结果表明，apCAFs与大多数肿瘤的抗肿瘤作用相关。
apCAF通过直接激活CD4+效应T细胞对NSCLC发挥抗肿瘤作用。作者研究了apCAF和CD4+效应T细胞在各种类型实体瘤中的关系。作者将在apCAF和其他CAF之间差异表达并且logFC最高的前40个基因作为apCAFs基因特征的候选基因。对于每种实体瘤类型，作者使用apCAFs特征基因和CD4+效应T细胞特征基因作为基因集。采用GSVA算法计算RNA-seq数据中每个样本的apCAFs基因特征评分和CD4+效应T细胞基因特征评分。研究结果发现，在TCGA-HNSC（图2E）和TCGA-OV（图2F)以及其他7个队列中，apCAFs基因特征评分与CD4+效应T细胞基因特征评分之间均显著正相关。同样，作者计算了每种实体瘤类型的scRNA-seq数据中每个细胞的apCAFs基因特征评分和CD4+效应T细胞基因特征评分。在HNSCC（图2G）和OV（图2H）以及包括NPC、BRCA、AM、CM和RCC在内的其他5个scRNA-seq数据队列中，apCAFs基因特征评分与CD4+效应T细胞基因特征评分之间均显著正相关。
研究表明，NSCLC的apCAF表达的补体C1Q分子可直接结合CD4+T细胞上的相应受体，从而促进CD4+T细胞存活。作者对其他实体瘤类型中的apCAF是否也表达补体C1Q分子进行了研究。与其他成纤维细胞亚群相比，在HNSCC和OV中，C1Q分子（即C1QA、C1QB和C1QC）在apCAF中的表达更高（如图2I、J)。同样，在NPC、CC、CRC、BRCA和AM中，也观察到了同样的结果。因此，apCAFs可能在这些实体瘤类型中通过C1Q分子表达促进CD4+T细胞的存活发挥抗肿瘤作用。
接下来，作者研究了与正常组织中的成纤维细胞相比，肿瘤内apCAF富集的分子通路。作者基于GSVA分析，得出各类型实体瘤中apCAFs和正常成纤维细胞（NFs）的选定通路的GSVA富集评分，并进行了差异分析。研究结果发现，免疫相关和炎症相关通路在这些类型的实体瘤apCAF中显着富集（如图2K、L）。当将apCAF与NFs进行比较时，apCAF在促进细胞杀伤、激活NK细胞和T细胞、促进T细胞介导的免疫和细胞毒性以及通过MHCI类和MHCII类分子呈递抗原方面的能力更强。此外，与大多数实体瘤中的其他成纤维细胞亚群相比，apCAF中抗原加工和呈递分子CTSS、LNPEP、RAB11A、TAP1和TAP2的表达量更高（如图2M，N）。上述结果强调了apCAFs在抗肿瘤免疫领域的潜在重要性。
apCAFs、肿瘤细胞和CD4+效应T细胞在各实体瘤中的富集分析
为了更详细地研究apCAFs、肿瘤细胞和CD4+效应T细胞之间的组织分布，作者利用了从HNSCC、OV、BRCA和CRC患者肿瘤组织切片中获得的ST数据进行后续分析。在HNSCC切片中观察到，肿瘤细胞和apCAFs富集区域明显分离。在肿瘤细胞富集的区域，apCAFs特征基因明显低表达，而在apCAFs富集的区域，肿瘤细胞特征基因亦明显低表达（如图3A，B）。此外，在HNSCC的ST中肿瘤细胞特征评分与apCAFs特征评分明显负相关（如图3C）。作者还发现了CD4+效应T细胞和apCAFs的共定位分布。即在CD4+效应T细胞特征基因富集区域，apCAFs特征基因高表达；在apCAFs特征基因富集区域，CD4+效应T细胞特征基因高表达（如图3D）。CD4+效应T细胞特征评分和apCAFs基因特征评分显著正相关（如图3E）。在OV切片中，也观察到了相似的结果，即肿瘤细胞特征基因富集区域明显区分于apCAFs特征基因富集区域（如图3F-G），以及肿瘤细胞特征评分明显与apCAFs特征评分呈负相关（如图3H）。除此之外，在OV样本中，CD4+效应T细胞和apCAFs共定位分布，以及CD4+效应T细胞与apCAFs特征基因的表达趋势也与HNSC一致（如图3I，J）。总之，通过观察在上述几种实体瘤中肿瘤细胞与apCAFs之间的组织分布，发现apCAFs与肿瘤抑制相关。此外，CD4+效应T细胞和apCAFs共定位分布表明，apCAFs可能通过促进CD4+效应T细胞的存活而发挥抗肿瘤作用。
apCAFs与T细胞亚群的相关性
通常肿瘤微环境中存在不同的T细胞亚群，包括CD4+T细胞、CD8+T细胞、Tregs和Th17细胞等。所以，作者对apCAFs与其他T细胞亚群的相关性进行了研究。首先利用同一种实体瘤的scRNA-seq数据，生成特征矩阵作为参考数据集。随后，使用CIBERSORTx算法对同种实体瘤的RNA-seq数据进行反卷积分析。通过上述方法可以获得每个样本在RNA-seq数据中的细胞类型特征分数。在TCGA-HNSC队列中，作者观察到apCAFs与总CD8+T细胞、枯竭CD8+T细胞和Tregs之间显著负相关（如图4A）。在TCGA-OV和TCGA-CESC队列中，apCAFs与所有的T细胞亚群均无明显的相关性（如图4B，D）。在GSE102349-NPC队列中，apCAFs与枯竭CD8+T细胞、Tregs明显负相关；与Th17细胞明显正相关（如图4C）。在TCGA-COAD和TCGA-READ队列中，apCAFs与原始CD4+T细胞、总CD8+T细胞、枯竭CD8+T细胞和Tregs显著正相关（如图4E，F）。在TCGA-BRCA队列中，apCAFs与总CD8+T细胞，枯竭CD8+T细胞显著负相关（如图4G）。在TCGA-SKCM队列中，apCAFs与枯竭CD8+T细胞和Th17细胞弱相关（如图4H）。在TCGA-KIRC队列中，apCAFs与所有T细胞亚群负相关（如图4I）。综上所述，apCAFs与其他T细胞的关系主要取决于肿瘤类型。这表明，尽管各实体瘤可能存在异质性，但是apCAFs可能参与调节T细胞介导的免疫反应。
apCAFs的来源
研究表明，巨噬细胞、树突状细胞、内皮细胞可以在一定条件下转化为成纤维细胞。这表明这些细胞可能是apCAFs的潜在来源。为了对apCAFs的来源进行研究，作者通过转录组相似性分析对apCAFs及其潜在的源细胞进行研究。通过对HNSCC样本的研究发现，apCAFs与NFs的转录具有相似性（如图5A），表明NFs可能是apCAFs的潜在来源。伪时间轨迹分析提供了从NFs到apCAFs的潜在差异化路径（如图5B，C）。在这一发展路径内，作者发现随着轨迹发展，CD74（apCAFs的特征基因之一）明显上调（如图5D）。在CC、NPC、RCC样本中，也观察到NFs与apCAFs的高度相似性。在CC样本中，通过伪时间轨迹分析也发现了从NFs到apCAFs的潜在发展路径（如图5F，G）。同样也发现CD74在该轨道上表达量上调（如图5H）。这些结果表明，NFs可能是apCAFs的潜在来源。
在apCAFs中转录因子（TFs）的富集
由于TFs是细胞增殖分化所必需的，所以作者对apCAFs内活化的TFs进行了研究。发现OTUD4、RUNX3和IKZF1等TFs主要富集于HNSCC样本中（如图6A），STAT4、RUNX3和IKZF1主要富集于OV样本中（如图6B），IKZF1、KLF3和RUNX3主要富集于NPC（如图6C），IKZF1、RUNX3和SPI1主要富集于BRCA（如图6D），IKZF1、RUNX3和BCL11B主要富集于CM（如图6E），以及IKZF1、TCF7和RUNX3富集于RCC（如图6F）。
apCAFs表现出明显的糖酵解代谢
大量研究表明，代谢过程可以调节免疫细胞功能。作者使用SCMetabolication算法分析不同类型实体瘤的成纤维细胞亚群的scRNA-seq数据。结果显示，与其他成纤维细胞亚群相比，在HNSCC（如图7A）、NPC（如图7B）、和BRCA（如图7C）中，糖酵解和糖异生通路在apCAFs内富集明显增多。为了进一步证明，作者采用GSVA算法计算糖酵解通路的GSVA富集分数，发现apCAFs的糖酵解通路GSVA富集分数显著高于所有其他成纤维细胞亚群，除了HNSCC（如图7D）、NPC（如图7E）和BRCA（如图7F）的eCAF。此外，作者使用scRNA-seq数据计算代谢通量，发现在HNSCC（如图7G）、NPC（如图7H）和BRCA（如图7I）中，apCAFs中丙酮酸到乳酸的代谢通量与其他成纤维细胞亚群相比较高。有趣的是，与其他成纤维细胞亚群相比，在HNSCC（如图7J）、NPC（如图7K）和BRCA（如图7L）的apCAFs中GLUT1和SLC2A1的表达更高。GLUT1作为糖酵解过程中的关键调节蛋白，帮助大多数细胞的葡萄糖跨膜转运。上述分析进一步验证apCAFs可能与糖酵解代谢相关。
研究总结：
根据上述研究结果显示，NF来源的apCAFs在不同实体瘤中普遍存在，并且通常与抗肿瘤作用有关。apCAFs可能与激活CD4+效应T细胞有关，并且可能通过表达C1Q分子来促进CD4+效应T细胞的存活。此外，apCAFs具有TFsRUNX3和IKZF1的特异性富集，以及显着的糖酵解代谢。这些发现为进一步探究apCAFs以及利用apCAFs免疫疗法的潜在治疗提供了新的思路。
