AAV（腺相关病毒）是一种常用于基因治疗和科研的非致病性病毒载体，其包装流程涉及多个关键步骤，以下是详细的操作流程及要点：
一、载体构建与准备
1. AAV 载体质粒设计
目的基因克隆：将目标基因（如治疗性基因、报告基因）插入到 AAV 载体质粒中，需位于反向末端重复序列（ITR）之间，确保基因表达。
2. 质粒提取与纯化
使用无内毒素质粒提取试剂盒（如 Qiagen EndoFree Plasmid Kit），确保质粒纯度（OD260/280≈1.8-2.0），避免内毒素影响细胞转染效率和病毒活性。
二、细胞培养与转染
1. 宿主细胞选择
常用细胞系：HEK293 细胞（贴壁细胞，易转染且产毒效率高）、HEK293T 细胞（含 SV40 大 T 抗原，适用于某些载体）。
2. 三质粒共转染
转染方法：钙磷共沉淀法：经典方法，成本低，适用于大规模生产，但转染效率受 pH 和温度影响；脂质体转染法（如 Lipofectamine 3000）：效率高，操作简便，适合实验室小规模包装。
质粒比例：载体质粒：辅助质粒：腺病毒辅助质粒≈1:1:1（或按优化比例），总转染量根据细胞密度调整（如 10 cm 培养皿用 10-15 μg 质粒）。
转染后培养：转染 4-6 小时后更换新鲜培养基，继续培养 48-72 小时，观察细胞病变（CPE）迹象（如变圆、脱落）。
三、病毒生产与收获
1. 细胞裂解与病毒释放
收获时间：转染后 48-96 小时（根据细胞状态确定，过早产毒量低，过晚细胞裂解严重）。
裂解方法：
反复冻融法：-80℃/37℃冻融 3 次，破坏细胞膜释放病毒。
超声破碎法：适用于大规模生产，但需控制功率避免病毒失活。
化学裂解：使用 Triton X-100 或 NP-40 等去污剂，结合酶消化（如 DNase I 降解基因组 DNA）。
2. 粗提液制备
裂解液离心（4℃、10000×g、15 分钟），收集上清液，用 0.45 μm 滤膜过滤去除细胞碎片，获得粗提病毒液。
四、病毒纯化
1. 氯化铯（CsCl）密度梯度离心
经典方法：配制 CsCl 溶液（密度 1.35-1.40 g/mL），与粗提液混合后超速离心（4℃、100000×g、16-20 小时）。病毒颗粒在密度梯度中形成白色条带，用针头穿刺管壁收集。透析去除 CsCl，用 PBS 或病毒保存液（含 10% 甘油）浓缩。
2. 层析法纯化
亲和层析：利用 AAV 衣壳蛋白与肝素的结合特性，通过肝素琼脂糖柱纯化，特异性高，适合规模化生产。
离子交换层析：根据衣壳蛋白电荷差异分离，需优化缓冲液 pH 和离子强度。
凝胶过滤层析：按病毒颗粒大小分离，可同时去除杂质和浓缩病毒。
3. 超滤浓缩
使用 100 kDa 分子量截留的超滤管（如 Amicon Ultra），4℃、3000×g 离心浓缩病毒液，同时置换缓冲液。
五、病毒滴度测定与质量控制
1. 滴度测定方法
qPCR 法（常用）：
提取病毒基因组 DNA，设计针对 ITR 或目的基因的引物，通过 qPCR 定量病毒基因组拷贝数（vg/mL）。
需制备标准品（已知拷贝数的质粒）建立标准曲线。
斑点杂交（Dot Blot）：半定量方法，灵敏度较低，适用于初步筛选。
感染性滴度测定（TTI）：用病毒感染细胞，通过报告基因（如 GFP）或 RT-PCR 检测感染细胞比例，计算感染性滴度（IU/mL），反映病毒活性。
2. 质量控制指标
纯度检测：SDS-PAGE 或 Western blot 检测衣壳蛋白（VP1、VP2、VP3），无明显杂蛋白条带。
无菌检测：细菌、真菌培养及内毒素检测（如鲎试剂法，内毒素≤10 EU/mL）。
活性验证：体外感染细胞，观察目的基因表达效率；体内实验需验证组织靶向性和安全性。
六、病毒保存与分装
分装：按实验需求分装为小剂量（避免反复冻融），常用保存液为 PBS（含 0.01% BSA 或 10% 甘油），防止病毒聚集。
保存条件：-80℃长期保存（避免 - 20℃，易导致病毒失活），使用时冰上融化并瞬时离心。
