RNA疗法代表了一类新兴的治疗方法，因其独特的理化性质和生理学特性，彻底改变了多种疾病的治疗方式并受到越来越多的关注。具体而言，RNA疗法能够通过靶向基因组、mRNA和蛋白质来精确调控基因转录和蛋白质表达，从而最大程度减少治疗过程中的脱靶效应和不良反应。与传统的小分子药物相比，RNA疗法具有显著优势，这源于其能够快速设计和生产，特别是针对新发现的靶点。此外，其给药剂量和频率的灵活性也增强了其在临床实践中的应用便利性。
在过去的十年中，美国食品药品监督管理局（FDA）批准了多种RNA疗法（图1）。例如，RNA适配体avacincaptad pegol用于治疗年龄相关性黄斑变性；帕提西兰（patisiran，全球第一款RNAi药物，商品名onpattro）作为一款小干扰RNA产品，适用于治疗遗传性转甲状腺素蛋白介导的淀粉样变性多发性神经病。此外，两种信使RNA（mRNA）疫苗已被广泛用于预防SARS-CoV-2感染。
尽管取得了显著进展，RNA疗法仍面临着与生产、有效递送和安全性相关的若干重大挑战。数十亿剂mRNA疫苗的成功生产证明了mRNA生产具有可扩展性，然而某些RNA疗法的生产工艺仍存在挑战。复杂的序列合成与纯化过程，以及对高精度的需求，使得难以维持RNA分子的质量和一致性。此外，RNA在体内有效递送至靶器官和靶细胞面临多重障碍，例如被内源性核酸酶降解和被网状内皮系统快速清除，阻碍了RNA在病灶部位的积累。同时，RNA分子的不稳定性及所带负电荷限制了其穿透细胞膜的能力，进一步阻碍了其到达靶细胞。最后，安全性问题——包括脱靶效应以及通过激活先天性免疫反应产生的免疫原性——可能降低治疗效果并引起不良副作用。迫切需要更深入地理解RNA分子并发展先进技术以克服这些挑战。
目前，对RNA的直接修饰和改进的递送系统代表了RNA疗法领域的主要研究焦点。在这里将重点讨论RNA的化学修饰，并聚焦于那些对未来RNA疗法的设计和开发最为相关的修饰。mRNA的化学修饰能显著减轻其炎症潜能或免疫原性，并增加蛋白质产量。这些发现为COVID-19大流行期间mRNA疫苗的加速开发奠定了基础。在最新的HELIOS-B III期研究（NCT04153149）中，N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）偶联的siRNA药物Vutrisiran（武特利兰）在治疗转甲状腺素蛋白淀粉样变性心肌病（ATTR-CM）患者中显示出令人鼓舞的安全性和有效性特征。最近，Vutrisiran已获得FDA批准用于治疗成人ATTR-CM。2023年底，首个获批的基于成簇规则间隔短回文重复序列（CRISPR）的疗法Exagamglogene Autotemcel（依加格洛根自体细胞疗法）获批用于治疗镰状细胞病和β-地中海贫血。临床证据表明，对RNA进行化学修饰可通过提高稳定性、增加蛋白质产量、优化递送效率、增强靶标亲和力以及最小化脱靶效应来提升治疗效果。因此，整合化学修饰是推进和优化RNA疗法的关键。
目前已发现或开发出多种类型的RNA。这些RNA包括：
小干扰RNA（siRNA）：通过RNA干扰（RNAi）通路在转录后水平调控基因表达；
微小RNA（miRNA）：与特定mRNA相互作用以调控基因表达；
适配体（aptamers）：结合特定分子并调节其活性；
信使RNA（mRNA）、环状RNA（circRNA）和自我扩增RNA（saRNA）：可被翻译成目标蛋白质；
CRISPR向导RNA（guide RNA）对于实现精确有效的基因编辑至关重要；
转运RNA（tRNA）和核糖体RNA（rRNA）在调控翻译过程中起关键作用；
Piwi相互作用RNA（piRNA）在保护生殖细胞基因组免受转座元件影响方面发挥重要作用。
这里主要聚焦于目前正被广泛开发用于临床治疗应用的RNA：小RNA（Small RNA）、可翻译RNA（Translatable RNA）。
小RNA
小RNA（small RNA）是一类天然存在或人工合成的短链寡核苷酸，在调控多种生物靶标中发挥关键作用。这类分子主要通过靶向特定分子（如基因或蛋白质），并通过多种机制影响其功能，包括：基因沉默（如RNA干扰介导的mRNA降解）、位阻效应（阻碍核糖体或转录因子结合）、剪接调控（促进外显子跳跃或保留）、翻译调节（抑制或增强蛋白质合成）、靶蛋白活性调控（直接或间接影响蛋白功能），核心优势在于对特定基因序列的精准靶向能力。
主要小RNA类别及作用机制：
1. 反义寡核苷酸（ASOs）
结构：单链DNA/RNA短序列（通常15–25 nt）。
作用机制：Gapmer型ASO——与靶mRNA结合后招募RNase H酶，直接降解mRNA；位阻型ASO——阻断核糖体结合或转录因子结合，抑制翻译；剪接调控型ASO——修饰pre-mRNA剪接位点，改变蛋白异构体表达（如治疗杜氏肌营养不良的Eteplirsen）。具有可调控剪接，适用于外显子跳跃疗法的临床优势。
2. 小干扰RNA（siRNA）
结构：双链RNA（21–23 bp，含引导链和过客链）。
作用机制：引导链整合至RISC复合体（含Ago2蛋白），通过碱基互补配对切割靶mRNA。具有高效持久沉默的临床优势。
治疗案例：Patisiran（首个获批siRNA药物，靶向转甲状腺素蛋白治疗淀粉样变性）
3. 微小RNA（miRNA）
结构：单链非编码RNA（~22 nt）。
作用机制：通过不完全互补结合靶mRNA 3'UTR，抑制翻译或促进降解（动物）。在植物中通常直接切割靶mRNA。多靶点调控特点，具有网络化作用，更适用于复杂疾病（如癌症、纤维化）。
4. 适配体（Aptamer）
结构：人工合成单链寡核苷酸，可折叠成特定三维结构。
作用机制：通过疏水力、氢键、碱基堆积等作用高亲和力结合靶蛋白（如抗VEGF适配体Pegaptanib治疗湿性黄斑变性）。类似抗体的功能能够直接结合蛋白，免疫原性弱。
小RNA的发展经历了ASO研究（1978年首次提出）→ siRNA发现（1998年Fire & Mello）→ miRNA调控网络（2000年后）→ 适配体筛选技术（SELEX）优化的路程。突破性进展在于化学修饰（如2'-氟代、硫代磷酸酯）解决稳定性问题，GalNAc偶联实现肝靶向递送。前沿挑战包括组织特异性递送（脑靶向siRNA，如靶向亨廷顿蛋白的RG6042）、动态调控系统（光控或生物标志物响应型RNA开关）、AI辅助设计（预测最优靶序列及修饰位点，如DeepMind开发RNA结构预测工具）。
小RNA的化学修饰通过提高安全性、稳定性、特异性及其他药理学特性，显著增强小RNA的治疗潜力。修饰可作用于小RNA的多个结构组分，包括：
1. 核糖（Ribose Sugar）修饰：增强稳定性、降低免疫原性、改善药代动力学特性、提高靶序列亲和力、减少脱靶效应。常见的有2′-O-甲基化（2′-O-Me）、2′-氟代（2′-F）、2′-甲氧乙基（2′-MOE）。如增强核酸酶抗性、延长体内半衰期的2′-MOE修饰的Nusinersen（Spinraza，治疗SMA）。
2. 磷酸骨架（Backbone）修饰：提升核酸酶抗性、延长半衰期、增强生物活性。典型修饰有硫代磷酸酯（Phosphorothioate, PS）键替换，可抵抗血清核酸酶降解。如改善组织分布、促进蛋白结合的硫代磷酸酯骨架修饰的Fomivirsen（首个ASO药物，抗CMV）。
3. 碱基（Nucleobase）修饰：降低免疫原性（如TLR7/8识别）、提高热稳定性。代表修饰有假尿苷（Ψ）、5-甲基胞苷（m5C）、N6-甲基腺苷（m6A）。如减少免疫原性、提高翻译效率的假尿苷修饰的COVID-19 mRNA疫苗（Moderna/Pfizer）
可翻译RNA
可翻译RNA是指能够被核糖体翻译并表达功能性蛋白的一类RNA分子，主要包括以下三种类型：
1. 信使RNA（mRNA）
结构特征：线性；5'帽结构（Cap）—— 如m7GpppN，促进翻译起始和稳定性；非翻译区（UTRs）：调控翻译效率（如Kozak序列优化）；编码区（CDS）：设计可优化密码子使用率（如人类偏好密码子）；3' poly(A)尾：长度影响半衰期（通常100–150 nt）。
治疗应用：疫苗开发（如COVID-19 mRNA疫苗）、蛋白替代疗法（如治疗甲基丙二酸血症的mRNA-3704）。翻译能够维持数天，应用时需要较高剂量（μg级），主要挑战在于控制免疫原性。
2. 环状RNA（circRNA）
生成机制：通过反向剪接（back-splicing）形成共价闭合环状结构。
稳定性优势：闭合环状；无5'帽/3'尾，抵抗核酸外切酶降解（半衰期可达线性mRNA的10倍以上）。
翻译启动方式：IRES元件（内部核糖体进入位点）驱动无帽翻译；m6A修饰（如UTR区m6A可招募翻译起始因子）。
潜在应用：长效蛋白表达（如凝血因子IX的circRNA疗法）、调控miRNA海绵作用（如肿瘤抑制性circRNA）。翻译能够维持数周，应用时需要中等剂量。主要挑战在于优化环化效率。
3. 自扩增RNA（saRNA）
结构特征：线性；含病毒来源元件——RdRP复合物基因（源自α病毒如西门利克森林病毒）和亚基因组启动子——驱动目标蛋白的高效表达。
核心优势：细胞内自我复制，蛋白产量提升10–100倍。低剂量即可实现长效表达（单剂量持续数周）。翻译能够维持数周至数月，应用时只需低剂量（ng级）。主要挑战在于监测复制安全性。
临床进展：传染病疫苗（如狂犬病saRNA疫苗）、癌症免疫治疗（如表达细胞因子的saRNA）。
在可翻译RNA中引入化学修饰可显著降低免疫原性，同时提升稳定性和蛋白产量。主要修饰类型及机制：
1. 尿苷（Uridine, U）修饰：假尿苷（Ψ）—— 抑制TLR信号通路（如TLR7/8），减少先天免疫激活；阻断PKR和OAS/RNase L通路，避免翻译抑制；如COVID-19 mRNA疫苗（Moderna/Pfizer）的核心修饰。N1-甲基假尿苷（m1Ψ）—— 比Ψ进一步降低免疫原性，延长蛋白表达时间；但可能引起核糖体移码（+1 frameshift），导致非预期抗原产生。其他尿苷修饰 —— 2-硫代尿苷增强mRNA抗氧化能力，提升结构稳定性；5-甲氧基尿苷减少免疫识别，提高翻译效率。【免疫逃逸 + 翻译增强】
2. 腺苷（Adenosine, A）修饰：N6-甲基腺苷（m6A）—— 调控mRNA稳定性（如TLR4 mRNA的m6A修饰增强中性粒细胞炎症反应）；驱动环状RNA翻译（依赖YTHDF3和eIF4G2）。N1-甲基腺苷（m1A）—— 例如通过ALKBH3去甲基化调控CSF-1 mRNA稳定性。【稳定性调控 + circRNA翻译启动】
3. 胞苷（Cytidine, C）修饰：5-甲基胞苷（m5C）—— 依赖NSUN2甲基转移酶和ALYREF蛋白，促进mRNA核质转运；增强IL-17A mRNA翻译，调控T细胞免疫应答。如在saRNA疫苗中降低IFN-I反应，延长Spike蛋白表达（SARS-CoV-2 saRNA疫苗）。【核质转运优化 + 低剂量长效表达】
优化可翻译RNA的序列和结构元件，包括非翻译区（UTRs）、5'帽结构和poly(A)尾，可显著提升RNA的稳定性、翻译效率及治疗效力。包括：
1. 非翻译区（UTRs）的工程化设计：5' UTR —— 调控核糖体招募和翻译起始效率，如经典序列α/β-珠蛋白UTR（增强稳定性和翻译）和深度学习筛选出最高效5' UTR（如用于megaTAL基因编辑酶的mRNA）；3' UTR —— 影响mRNA半衰期和蛋白产量，如高通量筛选 AES-mtRNR1 3' UTR可提升翻译效率并激活T细胞应答。强调人工智能辅助设计，如LinearDesign算法10分钟内优化mRNA序列、平衡密码子使用与二级结构稳定性（例如COVID-19疫苗序列设计）。
2. 5'帽结构的创新修饰：新型帽类似物技术 —— CleanCap® （一步法合成，效率>95%，简化生产工艺）；锁核酸（LNA）帽（翻译效率提升5倍，通过增强eIF4E结合）；双帽结构（Dual-Capped mRNA）（m7G帽+LNA/+1位2'-OMe修饰，蛋白产量提升100倍（vs 标准帽+m1Ψ修饰），在SARS-CoV-2疫苗中验证）；环状RNA帽化（m7G修饰通过分支结构激活circRNA内部翻译）。
3. Poly(A)尾的工程化突破：化学修饰 —— 叠氮腺苷（Azido-Ado）（提升报告蛋白表达量）、硫代磷酸酯（PS）+2'-MOE修饰（增强核酸酶抗性）；多尾mRNA（Multitail mRNA）（分支化poly(A)尾，形成多聚PABP结合位点，延长体内蛋白表达时间，低剂量实现多重基因编辑，但大规模合成需优化连接化学）。
但优化可翻译RNA的序列和结构元件依然存在瓶颈，比如双帽/多尾RNA需开发连续流生产工艺（如微流控技术）、LNA等修饰核苷酸的高成本限制临床转化。通过筛选TLR信号通路非依赖性帽类似物控制免疫原性、采用差异化poly(A)长度对肝靶向递送mRNA（如短尾减少肝外分布）是对安全性的优化。
挑战和局限性
1. 精准修饰的未解难题：RNA分子包含帽结构、UTR区域、编码序列等多元素，每个部位的化学修饰（如2′-O-甲基化、硫代磷酸酯键）对稳定性、翻译效率及免疫原性有差异化影响。例如，帽类似物（如CleanCap）可提升mRNA翻译效率，但UTR修饰对长期表达的影响机制尚未明确；CRISPR系统中，向导RNA（gRNA）的化学修饰（如2′-氟代、2′-O-甲基）虽可增强核酸酶抗性，但可能干扰Cas蛋白结合效率或靶向精度。
2. 脱靶效应与毒性控制：如GalNAc-siRNA偶联物虽实现肝靶向递送，但“种子区”（seed region）与非目标mRNA的部分互补仍可引发脱靶沉默；化学修饰（如假尿苷Ψ）虽可减少TLR7介导的免疫激活，但某些修饰（如N1-甲基假尿苷）可能干扰内源RNA加工通路，导致非预期免疫反应。
3. 合成工艺的复杂性：固相合成适用于短链RNA（如ASO），但长链mRNA依赖体外转录（IVT），需优化模板设计、帽类似物整合及纯化工艺。例如，IVT中双链RNA副产物可能激活先天免疫，需色谱技术去除。
4. 存储稳定性的挑战：LNP包封的mRNA在2–8°C下仅稳定数月，冻干技术可延长保质期但可能损伤RNA完整性。
5. 递送系统的免疫毒性：LNP组分（如可离子化脂质）可激活补体系统或诱导线粒体应激，导致肝损伤或细胞因子风暴。临床数据显示，肝靶向LNP的免疫毒性显著低于全身递送系统，但长期重复给药的安全性数据仍缺乏。仿生递送系统（如血小板膜包被纳米粒）通过伪装机制降低免疫识别，如在乳腺癌模型中将肝蓄积毒性降低40%。
6. 长期使用风险未知：遗传性疾病需终身用药，但修饰RNA的胞内长期滞留可能干扰内源RNA代谢通路，潜在致癌风险仍需长期毒理实验验证；ASO疗法中，RNase H依赖性机制可能导致非肝组织（如肾脏）的脱靶基因沉默，需通过组织分布谱优化递送策略。
7. 递送效率的核心挑战：内体逃逸效率低（pH响应载体（如ZIF-8）在酸性内体中解体，释放率达90%，但载体生物降解速率难以精准调控）、组织靶向不足（GalNAc偶联靶向肝细胞、抗体片段修饰靶向肿瘤抗原，但非肝器官靶向配体筛选滞后）、免疫原性（类外泌体载体利用内源膜蛋白可逃避免疫清除，但大规模生产标准化困难）。
RNA疗法的突破需多学科协同：化学修饰需兼顾功能与安全性、生产工艺需提升标准化与可及性、递送系统需攻克器官靶向与内体逃逸瓶颈、长期毒性需创新评估模型。未来，在智能化修饰设计（结合机器学习预测模型（如AlphaFold-RNA）优化修饰位点，平衡稳定性与功能干扰）、模块化生产平台（开发微流控连续流合成系统，整合修饰、纯化与载体包封步骤，提升批次一致性并降低成本）和长效安全性监测（建立类器官毒理模型模拟慢性暴露，结合单细胞测序追踪RNA代谢产物分布，预警潜在器官毒性）三个方向或有突破。
参考文献：Wang, S., Weissman, D. & Dong, Y. RNA chemistry and therapeutics. Nat Rev Drug Discov (2025).
