Nat Nano | 哈佛大学Wyss研究所发布世界最小纳米标尺创建多肽分子指纹

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从微量样本中解码生物分子的身份是生物技术领域的一个长期目标，尽管下一代测序技术已使识别单个DNA和RNA分子成为可能，但同样的能力还不能用于蛋白质。但是，在哈佛大学Wyss研究所、哈佛医学院（HMS）Blavatnik研究所和波士顿儿童医院（BCH）的分子机器人项目中工作的科学家们现在已经使用DNA创建了他们所说的可能是世界上最小的测量蛋白质的标尺。

这项被称为“DNA纳米开关卡尺”（DNC）的技术使研究人员能够通过施加少量的力，对单个肽进行高精度的距离测量。通过在同一分子上快速进行许多距离测量，DNC创建了一个独特的“指纹”，可用于在后续实验中识别同一分子。

“当你试图理解生物学中的某些东西时，有两种主要的探究方法：你可以在自然状态下观察你的对象，或者你可以干扰它并观察它的反应。”Wyss研究所副教员、HMS副教授、同时也是BCH的研究员Wesley Wong博士说，“观察可以提供许多重要的生物信息，但有时学习某些东西的最佳方式是与之进行物理交互。通过施加力来确定肽分子中氨基酸的模式是目前科学探索的一个新范例，该技术将使我们能够像目前对DNA进行测序一样轻松地对蛋白质进行测序。”

Wong是该团队发表在《Nature Nanotechnology》上的论文的通讯作者，该论文标题为“Single-molecule mechanical fingerprinting with DNA nanoswitch calipers”。

蛋白质在几乎所有的生物过程中都扮演着至关重要的角色，但这些分子比DNA和RNA复杂得多，并且常常经过化学修饰，使得单分子蛋白质组学样本中单个蛋白质的鉴定具有挑战性。作者写道：“DNA分析的进展已经极大地影响了临床实践和基础研究，但由于蛋白质的相对复杂性和我们无法放大它们，相应的蛋白质发展面临挑战。一种准确而全面地分析微量样品中蛋白质的方法将影响从诊断到细胞生物学的各个领域，但仍然是一个极具挑战性的目标……尽管质谱和质谱术等方法取得了进展，但单分子蛋白质鉴定仍然是一项极具挑战性的工作。”

DNC基于DNA纳米开关的底层技术。实际上，这是一条DNA单链，在其长度上的多个点上有分子“手柄”。当其中两个手柄相互结合时，它们会在DNA链中形成一个环，并且链的总长度会缩短。当用力拉开手柄时，该链会延伸回其原始长度。成环和未成环状态下的链条长度之差反映了环的大小，从而反映了手柄之间的距离。

研究小组意识到他们可以将DNA纳米开关再向前推进一步。如果他们将手柄设计成与生物分子结合，手柄可以像卡尺的两个尖端一样有效地将分子“夹”在它们之间，而不是相互结合。通过测量手柄之间添加的目标分子如何改变环状与非环状状态下DNA纳米开关的总长度，该团队假设他们可以有效地测量分子的大小。

“在某些方面，DNA纳米开关利用了一种最经典的机械方法来测量物体：只需对物体施加力，然后观察它是如何响应变化的。”共同第一作者、Wyss研究所和BCH的博士后研究员Darren Yang博士说，“这是一种我们在单分子蛋白质组学领域还没有真正看到使用过的方法，因为对如此小的物体施加力是非常具有挑战性的。但我们迎接了挑战。”

为了将他们的基于力的新测量技术的想法变为现实，Yang及其同事首先将两种不同类型的手柄连接到目标分子上：一种“强”手柄将分子牢牢固定在DNC的一端，另一种“弱”手柄可以连接到DNC的另一端。然后，他们将DNC的两端拴在悬浮在激光束中的两个光学捕获的珠子上。通过将珠子移近，它们诱导目标分子的一个弱手柄与DNC结合，从而形成环状状态。然后，当他们通过将珠子进一步分开来增加作用力时，弱手柄最终释放了它的纽带，使DNC恢复到其较长的未操作状态。

“DNA纳米开关是在特定位点装饰的DNA系链，具有直接相互结合或通过第三个桥接复合物结合的功能。”作者解释说，“绑定导致纳米开关的一部分环出，缩短了系链长度；当这些键断裂时，系链会延伸回原来的长度……本质上，从环状结构到非环状结构的长度变化反映了闭合环的分子桥的大小——桥越大，长度变化越小。”

该团队首先在简单的单链DNA（ssDNA）分子上测试了DNC技术，并确认DNC成环和未成环状态之间距离测量值的变化与目标分子的长度直接相关。这些长度变化可以用埃级精度（比DNA双螺旋的宽度小十倍）来测量，从而能够识别出与单个核苷酸一样小的长度变化。

由于目标分子包含多个可与DNC结合的弱手柄，因此结合和破坏这些手柄的重复循环会在强柄和弱柄之间产生一系列距离测量值，这些测量值对于每个被测分子都是唯一的。这种“指纹”可用于识别样本中的已知分子，或推断未知分子的结构信息。

在确认DNC可以可靠地测量DNA分子的大小之后，研究人员将重点转移到蛋白质上。他们设计了一种已知长度和序列的合成肽，并重复实验，通过强手柄将其连接到DNC的一端，并通过施加不同大小的力反复连接和断开其弱手柄与DNC之间的键。

他们发现，他们的工具测量的强手柄和弱手柄之间的所有距离都与基于DNC长度和肽中氨基酸长度的预期距离相匹配。当他们使用DNC测量一种称为NOXA BH3的天然线性化肽时，也得到了类似的结果。

这一过程也为每个肽生成了独特的测量指纹。“对单个分子进行多次距离测量可以创建可用于蛋白质识别的机械指纹……”他们写道。该团队创建了一个计算机模型来预测使用这种方法可以唯一识别出多少人类蛋白质，并发现在常用蛋白质数据库中，超过75%的蛋白质可以通过指纹识别，概率至少为90%。

“实际上，我们对这项技术的效果感到有些惊讶。”共同第一作者、Wyss研究所和BCH的博士后Prakash Shrestha博士说，“光镊已经存在了几十年，DNA在环态和非环态之间循环已经存在了大约10年，我们不确定结合这些想法是否可以获得足够高分辨率的测量结果。但事实证明，这些指纹对于识别蛋白质非常有效。”

识别单个蛋白质分子本身就是一项令人印象深刻的壮举，但能够同时识别多个蛋白质是单分子蛋白质组学的真正圣杯。该团队进一步证明，通过用磁镊系统替换光珠，他们能够并行测量多种不同的肽，并确定不同分子的相对浓度。他们写道：“使用光镊，我们证明了DNA和肽的绝对距离测量具有ångström级精度，并使用多路磁镊展示了混合样品中相对丰度的量化。”

“我们还通过在多路磁镊系统上实施该分析，演示了如何通过并行化提高吞吐量。这使我们能够测量异质混合物中不同比例肽的相对浓度。”

共同通讯作者、Wyss研究所核心教员、HMS和Dana-Farber癌症研究所教授William Shih博士进一步评论道：“由于尺度和分辨率方面的挑战，单分子蛋白质组学在很大程度上仍然是一个白日梦。我们目前的工作表明，基于力的序列指纹技术有可能实现这一梦想。我们的最终目标是不仅以高通量方式有效读取蛋白质序列，而且还有效读取蛋白质结构。”

科学家们朝着这个目标迈出的下一步是验证他们的卡尺对折叠蛋白质及其复合物的低作用力结构测量，研究它们在结构生物学和蛋白质组学中的潜在用途。他们写道：“DNC有可能被用来测量蛋白质折叠结构中多个残基之间的距离，这将使生物分子和生物分子复合物的动态3D结构的表征成为可能，补充现有的生物物理结构阐明方法。”

该团队还致力于提高该技术的吞吐量，以进一步加快混合样本的分析速度。他们建议：“DNC还可以集成到其他力谱方法中，以结合其他功能或提高动态范围、空间精度或吞吐量。DNC提供了一种强大的方法来表征纳米级复合物中的距离和几何形状，有可能影响从蛋白质组学和纳米技术到结构生物学和药物发现等广泛领域。”

“这项研究将分子生物物理学与Wyss研究所首创的尖端DNA纳米技术相结合，使我们能够以一种真正新颖的方式与生物分子进行互动和分析。”Wyss创始董事Don Ingber博士说，他也是哈佛医学院和BCH的Judah Folkman血管生物学教授，以及哈佛大学John A. Paulson工程与应用科学学院的生物工程教授。“当William和Wesley首次将这一想法作为新成立的分子机器人计划的核心挑战时，它看起来确实像科幻小说，但这正是我们希望在Wyss承担的项目类型。我为团队将这项技术变为现实感到非常自豪。它有可能彻底改变我们从事科学研究和开发治疗方法的方式。”