研究背景：
脊髓损伤（SCI）是一种导致永久性感觉运动缺陷和瘫痪的严重致残性疾病，全球发病率约为10.5/10万人。SCI病理过程分为原发性损伤和继发性损伤两个阶段：原发性损伤由机械性创伤直接造成神经元坏死、轴突断裂和血脊髓屏障破坏；继发性损伤则在数分钟至数周内发生，涉及免疫激活、持续性神经炎症和显著氧化应激，导致神经元凋亡、脱髓鞘和反应性胶质增生，形成抑制性微环境，严重阻碍内源性神经修复。目前，传统临床干预手段在实现根本性神经修复和功能恢复方面效果有限，亟需开发能同时针对神经炎症、氧化应激和抑制性损伤微环境的新型治疗策略。
针对上述问题，南通大学第二附属医院崔志明团队设计了一种可注射自愈合水凝胶系统（OCT-QM/AEVs@siRNA），通过星形胶质细胞来源外泌体介导的siRNA靶向递送联合槲皮素-锰复合物（QM）抗氧化治疗，协同抑制A1型星形胶质细胞激活和神经元铁死亡，促进SCI后神经修复。
（1）RNA测序筛选SCI靶基因及AEVs@siRNA纳米颗粒的制备与表征
RNA测序分析SCI小鼠脊髓组织，共鉴定3368个差异表达基因（2185个上调，1183个下调）（图1A、B）。火山图显示Pttg1、Mmp12及Serpina3n等基因显著上调。GO富集分析表明差异基因主要参与免疫系统过程调控；KEGG分析显示TNF信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用、Toll样受体信号通路、NOD样受体信号通路和趋化因子信号通路显著富集（图1C-F）。Serpina3n被确定为关键靶基因，该基因在星形胶质细胞中高表达，可调控其反应性极化。
图1. 通过RNA测序筛选SCI靶基因。(A)差异表达基因聚类热图。(B)差异表达基因火山图。(C–D)差异表达基因GO富集分析。(E–F)差异表达基因KEGG通路富集分析。
CS/HA纳米颗粒在HA/CS质量比1:1时粒径最小（72.75±11.29 nm），PDI为0.193±0.06，Zeta电位为13.78±1.46 mV（图2A-C）。siRNA与CS/HA质量比1:15时包封效率超过75%（图2D、E），CHS NPs粒径为88.41±3.21 nm（图2F）。差速超速离心提取AEVs，TEM显示典型杯状结构（图2G），NTA主峰位于115 nm（图2H），WB检测CD9、CD63、TSG101高表达（图2I）。AEVs@siRNA NPs粒径为125.25±2.87 nm，PDI为0.223±0.06，Zeta电位为-12.43±1.87 mV，TEM显示均匀球形结构（图2J）。AEVs@siRNA在RNase A和50% FBS中4-24 h保持稳定（图2K），4°C储存7天粒径无显著变化（图2L），包封效率约72.3±1.5%，载药量约4.6±0.5%。
图2. AEVs@siRNA纳米颗粒的表征。(A)不同HA/CS质量比制备的CS/HA纳米颗粒水动力学粒径分布；(B)不同HA/CS质量比制备的CS/HA纳米颗粒Zeta电位；(C)HA/CS质量比1:1时CS/HA纳米颗粒的形貌和光散射分析；(D)不同siRNA与CS/HA比例制备的CHS纳米颗粒琼脂糖凝胶电泳；(E)不同siRNA与CS/HA比例制备的CHS纳米颗粒siRNA包封效率；(F)CHS纳米颗粒水动力学粒径分布；(G)C8-D1A星形胶质细胞来源细胞外囊泡TEM图像（比例尺：200 nm）；(H)C8-D1A星形胶质细胞来源细胞外囊泡NTA结果；(I)C8-D1A星形胶质细胞及其细胞外囊泡标志蛋白（CD9、CD63、TSG101和Calnexin）WB分析；(J)AEVs@siRNA纳米颗粒TEM图像（比例尺：200 nm）；(K)AEVs@siRNA纳米颗粒在RNase A和50% FBS溶液中的稳定性琼脂糖凝胶电泳评估；(L)AEVs@siRNA纳米颗粒4°C储存1周的粒径测量。
（2）QM纳米颗粒的制备与表征及OCT-QM/AEVs@siRNA水凝胶的构建
Que与MnCl₂·4H₂O按1:1摩尔比在碱性环境中80°C回流反应6-8 h合成QM纳米颗粒。DLS测得QM平均粒径约135.62±1.34 nm，TEM显示不规则球形结构，平均粒径约120 nm（图3A）。Zeta电位：Que为-20.07 mV，MnCl₂为3.80 mV，QM为-15.73±1.58 mV（图3B）。UV-Vis光谱中Que最大吸收峰位于272 nm和375 nm，QM红移至303 nm（图3C）。FTIR显示Que中3000-3500 cm⁻¹的-OH伸缩振动峰在QM中减弱、展宽并移向低波数，1666 cm⁻¹的-C=O峰强度降低（图3D）。XPS证实QM含锰约26.57±3.12%（图3E）。H₂O₂清除实验显示QM抗氧化能力显著优于游离Que（图3F）。
图3. QM纳米颗粒的表征。(A)合成QM纳米颗粒的水动力学粒径分布和TEM图像（比例尺：500 nm）；(B)不同制剂的Zeta电位测量；(C)Que和QM纳米颗粒在240-600 nm范围内的UV-Vis吸收光谱；(D)Que和QM纳米颗粒的傅里叶变换红外（FTIR）光谱；(E)QM纳米颗粒的X射线光电子能谱（XPS）；(F)Que和QM纳米颗粒的H₂O₂清除效率。
OSA通过高碘酸钠氧化SA制备，FTIR在1725 cm⁻¹处出现醛基特征峰（图4A、B）。OSA、CMCS和TA混合后3 min内凝胶化（图4C），切断后10 min内自修复（图4D），具有湿态组织粘附性（图4E）和可注射性（图4F）。SEM显示冻干OCT水凝胶为均匀有序三维多孔网络结构（图4G）。流变学测试：0.1-100 rad/s频率范围内G'始终高于G''（图4H）；低应变下G'>G''，高应变下G'下降、G''上升（图4I）。OCT-QM/AEVs@siRNA水凝胶在37°C PBS中7天约10%残留（图4J），60 min内达200%溶胀平衡（图4K）。Cy5-siRNA 144 h累积释放率83%（图4L）。
图4. OCT-QM/AEVs@siRNA水凝胶的表征。(A)海藻酸钠在高碘酸钠条件下形成氧化海藻酸钠的示意图；(B)氧化海藻酸钠和海藻酸钠的傅里叶变换红外光谱；(C)OCT水凝胶在室温下的凝胶形成图；(D)制备的OCT水凝胶自愈合过程图；(E)制备的OCT水凝胶体外粘附图；(F)制备的OCT水凝胶可注射性测试结果；(G)制备的OCT水凝胶扫描电子显微照片；(H)OCT水凝胶频率扫描图；(I)OCT水凝胶振幅扫描图；(J)OCT-QM/AEVs@siRNA水凝胶不同时间的体外溶蚀曲线；(K)OCT-QM/AEVs@siRNA水凝胶溶胀率曲线；(L)OCT-QM/AEVs@siRNA水凝胶siRNA释放曲线
（3）细胞摄取、溶酶体逃逸及体外星形胶质细胞激活抑制研究
AEVs@siRNA、QM/AEVs@siRNA和OCT-QM/AEVs@siRNA组在2、12、24 h的细胞摄取效率均显著高于游离siRNA组，荧光强度随时间递增并于24 h达峰值（图5A）。3D细胞球模型中，上述三组绿色荧光细胞均匀分布于球体内部（图5B）。溶酶体逃逸实验显示，AEVs@siRNA与C8-D1A细胞孵育2 h时FAM-siRNA与LysoTracker共定位较少，6 h时共定位显著增加，12 h时共定位区域逐渐减弱（图5C）。TNF-α/IL-1β刺激后Serpina3n表达显著上调，AEVs@siRNA和OCT-QM/AEVs@siRNA处理显著降低其表达，游离siRNA和AEVs组无显著影响（图5D）。
图5. 细胞摄取研究。(A)siRNA、AEVs@siRNA、QM/AEVs@siRNA或OCT-QM/AEVs@siRNA纳米颗粒与C8-D1A细胞孵育2、12和24 h后的细胞摄取；(B)siRNA、AEVs@siRNA、QM/AEVs@siRNA或OCT-QM/AEVs@siRNA纳米颗粒与神经细胞3D球体孵育24 h后在不同深度的分布；(C)AEVs@siRNA纳米颗粒处理2、6和12 h后的细胞内溶酶体逃逸；(D)WB检测Serpina3n表达（n=3）。统计学分析采用单因素方差分析（ANOVA），随后进行Tukey事后检验。数据以平均值±S.E.M.表示。##p<0.01 vs.对照组。
TNF-α/IL-1β刺激显著增加C3和GFAP表达，AEVs@siRNA、QM/AEVs@siRNA和OCT-QM/AEVs@siRNA处理明显逆转C3表达（图6B）。TNF-α/IL-1β刺激显著上调p-IKKα+β和p-NFκB p65蛋白水平，上述三种纳米药物处理显著降低这些蛋白表达（图6C-E）。
图6. OCT-QM/AEVs@siRNA纳米颗粒对TNF-α/IL-1β诱导的C8-D1A星形胶质细胞激活的影响。(A)细胞实验示意图；(B)免疫荧光双染检测C3和GFAP表达；(C-E)WB检测p-IKKα+β和p-NFκB p65表达（n=3）。统计学分析采用单因素方差分析（ANOVA），随后进行Tukey事后检验。数据以平均值±S.E.M.表示。##p<0.01 vs.对照组，**p<0.01 vs.TNF-α/IL-1β组。
