谷氨酰胺合成酶（GS）活性测定方法
一、实验步骤
1. 取冷冻小麦样品0.5g样品置于2ml离心管中，每个管放一个钢珠，放入研磨器盘，一起放液氮中预冷，预冷后用研磨器研磨。
2. 研磨好拿出来，加入1.5ml的Tris-Hcl缓冲液。
3. 于4℃，13,000 r/min离心20min，上清液即为粗酶液。
4. 按照以下顺序向5ml离心管中分别加入：0.6ml咪唑-盐酸缓冲液+0.4ml谷氨酸钠+0.4mlATP-Na+0.2ml MgSO4+0.3ml粗酶液+0.3mlTris-HCL缓冲液。
5. 于25℃水浴5分钟，加入0.2ml羟胺反应15分钟后，加入0.8ml FeCl3终止反应。
6. 混合液于8000r/min离心8min后取上清液于540nm比色测定吸光值（对照用Tris-HCL代替酶液）。
二、试剂配制
1 100mmol/L、PH7.6的Tris-HCL缓冲溶液
把6.057gTris、0.1016gMgcl2.6H2O、0.1461gEDTA、0.3520ml ß-巯基已醇溶解后在500ml容量瓶中混合，加入去离子水450ml，用1M HCL调PH=7.6,最后用去离子水定溶到500ml(味道刺鼻，口罩戴好！！！！！）。
2 0.25mol/L、PH7.0的咪唑—盐酸缓冲液
取4.255g咪唑于容量瓶中，加去离子水200ml，用1M HCL调PH=7.0，用去离子水定溶到250ml。
3 0.3mol/L、PH7.0的谷氨酸钠溶液
称取5.6139g谷氨酸钠于100ml容量瓶中，加入去离子水80ml, 用1M HCL调PH=7.0，用去离子水定容到100ml。
4 30mmol/L、PH7.0的ATP-Na溶液（现用现配）
1g ATP-Na于容量瓶，加入去离子水45ml, 用NaOH调PH=7.0,再加入5ml去离子水。
5 0.5mol/L的MgSO4溶液
称取30.81g MgSO4于250ml容量瓶中，加入200ml去离子水使其充分溶解，后定容到250ml。
6 羟胺试剂
(1)1mol/L NH2OH·HCL 3.4745g NH2OH.HCL用去离子水定溶到50ml
(2) 1mol/L NaOH 2.0g NaOH用去离子水定溶到50ml
使用前等体积混合即可
7 FeCl3试剂
(1)0.2mol/LHCL 4.175mlHCL用去离子水定溶250ml
(2)10%（w/v）FeCl3.6H2O 10g FeCl3.6H2O于100ml烧杯中，用0.2mol/L HCL溶解并定溶100ml。
(3) 24%（w/v）三氯乙酸 60g三氯乙酸，用蒸馏水定溶250ml
(4) 50%(v/v)HCL 50mlHCl用蒸馏水定溶到100ml
等体积混合(2)、(3)、(4)三种溶液即可
调节pH时使用1mol/L的HCL溶液（20.875ml浓HCL定容到250ml）和1mol/L的NaOH溶液（40gNaOH用去离子水定容到1000ml)。
四.关于标准曲线
制作标准曲线的γ-谷氨酰异羟肟酸用量一般为1—5μmol之间，按照测定酶活的反应液总体积定容后，加入1mlFeCL3试剂，在540nm处测定光密度，绘制标准曲线。
药品 γ—谷氨酰基异羟肟酸 （GMH），Fecl3显色剂
C5H10N2O4 M=162.14
称取GMH10mg（0.01g），加水6.17ml，即为10微摩尔/ml的GMH。
1mlGMH中 加入0.8ml Fecl3测定A540nm处吸光值。
