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1 单个疾病分析
2 单个疾病结合免疫浸润，铁死亡，自噬等相关分析
3 两种相关疾病联合分析，包括非肿瘤结合非肿瘤，非肿瘤结合肿瘤或者非肿瘤结合泛癌分析

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研究概述

骨关节炎（OA）是一种对老年人影响较大的退行性关节疾病，以关节软骨的退变、变性为典型表现，常引起关节软骨丢失及软骨下骨改变，患病率随着年龄的增长而上升。目前其病因及发病机制仍不十分清楚。

在这项研究中，作者使用生物信息学方法识别了与OA免疫相关的生物标志物，确定了两种不同的分子亚型（ClusterA和ClusterB），并对不同分子亚型的预后、免疫浸润和功能途径进行了分析。总之，本研究对于OA免疫微环境的早期诊断、治疗和预后具有重要的临床意义。

流程图

研究结果

一、识别OA免疫相关差异表达基因

1、从GEO数据库下载微阵列数据集，通过主成分分析（PCA）处理后，筛选得到69个OA样本和34个对照样本（下图）。

2、通过差异表达分析确定OA样本和对照样本之间的差异基因（DEGs），其中83个基因表达上调，22个基因表达下调（下图A-B）。通过交叉DEGs和免疫基因识别差异表达的免疫基因（下图C）。这些交叉点产生了28个Imm-DEG（下图D），其中26个基因表达上调（下图E），2个基因表达下调（下图F）。

3、绘制OA样本和对照样本中Imm-DEGs表达差异的热图（下图A）。结果显示，大多数基因在OA样本中的表达水平高于正常样本（下图C）。

二、构建风险预后特征

1、利用LASSO回归从28个Imm-DEG中识别出16个对OA有较大影响的特征基因（下图A-B）。

2、根据这16个特征基因的系数得出风险评分（下图C-D），ROC曲线结果显示这16基因特征的预测效能较好（下图E）。

3、根据风险评分和16特征基因创建列线图（下图A-B）。校准曲线和决策曲线分析显示，该列线图的临床预测性能较为可靠（下图C-D）。

4、分析16基因特征与基因表达水平之间的相关性。结果显示，在所有样本中，IGKV1-17与IGLC1的相关系数为0.95；ADIPOQ与LEP呈正相关；LEP与除ADIPOQ外的所有其他基因呈负相关（下图A）；其中IGKV1-17、IGLC1和其他基因之间的功能相关系数达到0.9（下图B）。

5、在OA样本中，IGKV1-17与IGLC1的相关系数为0.94；ADIPOQ与LEP和SPP1呈正相关；LEP与除ADIPOQ之外的所有其他基因呈负相关（下图C）；OGN与大多数其他特征基因呈负相关；其中IGKV1-17和IGLC1之间的相关系数为0.89（下图D）。

三、16特征基因的不同免疫学亚型

1、基于16特征基因的不同表达模式建立了两种免疫亚型（clusterA和clusterB）。其中clusterA中有34个样本，clusterB中有35个样本。

2、构建所有差异表达免疫基因的热图（下图A）。结果显示，ADIPOQ、LEP、OGN和TAC1在clusterA中的表达水平显著低于clusterB；而HLA-DMA、HLA-DMB、HLA-DPA1、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DRA、TLR7、CCL18、CXCL10、MMP9、BLNK、IGHM、IGKV1-17、IGLC1、IGLV1-44、CXCL13、CXCL6、CXCL9、SPP1、IL10RA、SDC1、TNFRSF17和TRBC1在clusterA中的表达水平显著高于clusterB（下图B)。

3、评估这两种免疫亚型的ROC曲线。结果表明，这16个基因都可以独立区分clusterA和clusterB（下图C）。

四、构建PPI免疫基因网络

1、构建DEG、Imm-DEG和16基因特征的PPI网络以探索差异表达的免疫基因之间的关系。结果显示，DEG的PPI网络包含211个相互作用对和75个基因，其中MMP9与19个DEG密切相关，而CXCL10与16个DEG相关（下图A）；Imm-DEGs的PPI网络包含58个相互作用对和24个基因，其中CXCL10和MMP9与10个差异表达的免疫基因密切相关，而CXCL13和HLA-DRA与8个差异表达的免疫基因相关（下图C）；基因特征的PPI网络包含25个相互作用对和15个基因，其中CXCL10和MMP9与10个Imm-DEG密切相关，而CXCL13和HLA-DRA与8个Imm-DEG相关（下图E）。

2、利用富集分析验证这3个PPI网络中基因的功能。结果显示，DEG主要富集在脂肪细胞因子信号、糖酵解/糖异生、Toll样受体、细胞因子受体IL-17信号以及类风湿性关节炎等通路中（下图B）。差异表达的免疫基因主要富集在肠道免疫网络中IgA的产生、病毒蛋白与细胞因子和细胞因子受体的相互作用等途径中（下图D）。

五、两种免疫亚型的差异分析

1、在两种免疫亚型中获得了168个差异表达基因。其中cluster A中有93个上调基因和75个下调基因（下图A）。热图显示这些DEG可以区分两种不同的免疫亚型（下图B）。

2、分析两种免疫亚型之间的DEG的功能（下图A）。结果显示，这些DEG富集在细胞因子-细胞因子受体相互作用、趋化因子信号传导、疟疾和TNF信号传导以及NOD样受体信号通路中（下图B）。

3、GSEA分析结果显示，骨关节炎主要与免疫反应激活和脂肪酸代谢密切相关。

六、两种免疫亚型之间的免疫特征差异

1、利用CIBERSORT算法评估两种不同免疫亚型之间的免疫细胞浸润水平。分析显示，cluster A中M2巨噬细胞、静息状态下树突细胞和肥大细胞、活化的NK细胞和调节性T细胞的水平显著低于cluster B（下图A）。然而，M1巨噬细胞、活化肥大细胞、浆细胞和T滤泡辅助细胞的水平显著高于cluster B（下图B）。

2、计算cluster A和cluster B中的免疫细胞含量。分析显示，cluster A中的T滤泡辅助细胞与活化的记忆性CD4+T细胞呈显著正相关，而与活化和静息状态下的肥大细胞、M2巨噬细胞和B细胞呈显著负相关（下图C）；在cluster B中，γδT细胞、M1巨噬细胞、T滤泡辅助细胞和活化的肥大细胞与调节性T细胞呈正相关，而调节性T细胞与M1巨噬细胞呈负相关（下图D）。

3、计算所有OA样本（下图E）、clusterA（下图F）和cluster B（下图G）样本中的16种基因特征和免疫细胞类型之间的相关性。结果显示，TAC1与cluster B患者的免疫细胞含量无关，记忆性CD4+T细胞和活化的NK细胞与基因特征无关。

七、qRT-PCR验证hub基因的表达水平

1、实验结果显示：IL-1β诱导后，TCA1、TLR7、MMP9、CXCL10、CXCL13、HLA-DRA、ADIPOQ和SPP1的mRNA表达水平在正常人（下图A）和骨关节炎患者（下图B）中均显著升高，其中CXCL10的上升趋势最明显。

总结

在这项研究中，作者鉴定出骨关节炎的关键生物标志物，确定了两种不同的免疫亚型（ClusterA和ClusterB），并使用CIBERSORT等方法分析了不同免疫亚型之间的免疫细胞浸润水平的差异。最后实验结果显示，TCA1、TLR7、MMP9、CXCL10、CXCL13、HLA-DRA和ADIPOQSPP1在IL-1β诱导组中的表达水平显著高于骨关节炎组，还表明骨关节炎可能与免疫反应有关。