1855年9月26日上午，16岁的洛克菲勒走进从事农产品运输代理的休伊特-塔特尔公司。接见他的是二老板亨利·B.塔特尔，他需要一个记账员，于是考虑让洛克菲勒担任。午饭后，再次来到公司的洛克菲勒见到了大老板艾萨克·L.休伊特，这位大老板在仔细看完洛克菲勒的字后，说：“留下来试试吧。”得到聘用的洛克菲勒欣喜若狂，当时的激动心情即使洛克菲勒在老年回想起来仍记忆犹新。从此9月26日这个日子成了洛克菲勒的就业纪念日，他把这个日子当作自己的第二个生日来庆祝。
担任记账员的洛克菲勒成天埋头于账本里，对工作的态度是一丝不苟，他回忆说：“由于我第一份工作是记账员，所以我学会了十分尊重数字和事实，无论它有多小……”后来公司让洛克菲勒负责付账单，他对待这项工作的态度更是谨慎认真，每次都要仔细核查，用洛克菲勒自己的话说——“比花自己的钱还尽心”。对于出现的几分钱的小差错，洛克菲勒都不能忍受，这种负责尽职的态度让老板非常满意。此外，年轻的洛克菲勒在为休伊特老板收房租时，不仅表现得有耐心、有礼貌，而且还表现出了斗牛犬般不屈不挠的精神，即不收到房租决不罢休。除了记好账外，洛克菲勒还常为公司经营方面出主意。有一次，公司买入一批大理石，打开包装后发现，高价购进的大理石材上有瑕疵，老板沮丧不已但又无计可施。这时，头脑灵活的洛克菲勒建议把责任推到负责运货的3家运输公司头上，向这3家公司分别提出赔偿损失的要求。这个绝妙的主意使商行得到的赔款比原来高出两倍。洛克菲勒优秀的表现颇得老板赏识，在1855年年底，休伊特支付洛克菲勒50美元作为头三个月的工钱。紧接着不久，休伊特又宣布，这位助理记账员的工资将升到每月25美元。洛克菲勒追忆到：“就在那儿，我开始了学做生意的生涯，每周工资是5美元。”
1858年，年仅19岁的洛克菲勒在朋友莫利斯·克拉克的提议下，与之合伙创立了一家经营农产品的公司。洛克菲勒以10%的利息从父亲那里借来1000美元，加上自己储蓄的800美元，他创办了生平第一个合伙公司——克拉克-洛克菲勒公司。新公司的经营非常顺利，第一年就做了4.5万美元的生意，净赚4000美元，第二年年底净赚1.2万美元。在经营过程中，克拉克对洛克菲勒的经营能力十分赞赏，他在描述当年的情况时说：“他有条不紊到极点，留心细节，不差分毫。如果有一分钱该给我们，他必取来。如果少给客户一分钱，他也要客户拿走。” 洛克菲勒做生意时总是信心十足、雄心勃勃，同时又言而有信，想方设法使自己取信于人。
