前期记录
先确定目标基因
CRISPR/Cas9基因敲除实验全记录（1）
然后对目的基因进行背景调查
CRISPR/Cas9基因敲除实验全记录（2）磨刀不误砍柴工
设计sgRNA及引物
CRISPR-Cas9（三）--sgRNA设计好之后
CRISPR/Cas9基因敲除实验全记录（3）sgRNA及引物设计
CRISPR/Cas9基因敲除实验全记录（4）构建sgRNA+Cas9载体
转染验证
CRISPR/Cas9基因敲除实验全记录（5）293FT细胞转染验证 and trouble shooting
事实上，在转染验证结束后，对于癌细胞等易转染细胞系，基本上可以立刻进行转染，如果载体带有荧光，则根据荧光筛选阳性细胞，若载体为抗生素抗性，而经过抗生素筛选后可直接进行下一步单克隆细胞筛选。对于难以转染的细胞系，可使用电转或者特殊的转染试剂，再根据荧光或者抗性筛选。
将细胞消化过筛后种96孔板，每孔种一个细胞，前提是要有活细胞工作站，可以定时拍照1星期以上，从而确定单细胞克隆，如果没有这样的仪器，网络上还有其他筛选单细胞的教程，比如稀释法等等（我觉得直接种1孔1个细胞就OK，种完就找到得力的显微镜全孔拍摄）。总而言之，筛选单细胞这一步依赖于实验室平台的条件。
我已经在前两周完成了转染+荧光筛选+扩增冻存一部分，目前种板准备筛选单细胞克隆。由于我养的细胞属于非常难转的细胞系，使用了特殊的转染试剂，转染过后细胞不耐受，荧光筛选之后更加脆弱，实验周期相应拉长。注意，最迟最迟在确认转染成功后开始订购所需的验证性抗体。实验并非一个人可以完成，这和实验室的管理，补给，运营还有实验室成员的帮助有很大的关系，每一个微小的步骤都有可能把人卡得生不如死，希望能顺顺利利，感恩。
2019/09/03
