最近在血液中发现的细胞外rna，包括细胞外囊泡(EVs)中的rna，再加上低起始量rna测序的进展，使科学家能够研究它们在人类疾病中的作用。迄今为止，大多数研究都集中在小rna上，而且缺乏优化长rna测量的方法。我们使用血浆RNA评估了六种长RNA测序方法在两个不同位点的性能，并报告了它们在基因组/转录组的reads（%）、检测到的基因数量、长RNA转录本多样性和可重复性方面的差异。使用最佳的方法，我们进一步比较了EV和不含EV的RNA血浆中长RNA的谱。
文章信息
- 文献标题：Profiling Extracellular Long RNA Transcriptome in Human Plasma and Extracellular Vesicles for Biomarker Discovery
- Doi：https://doi.org/10.1016/j.isci.2020.101182
- 发表时间：iScience June 26, 2020
- 通讯作者：
- Keuren-Jensen 凤凰城 翻译基因组学研究所 神经基因组学学部
- Saumya Das 心血管研究中心，马萨诸塞州总医院，哈佛医学院
实验方案设计
为了系统地比较文库构建试剂盒/条件，我们使用了来自两个独立血浆样本池的总RNA。我们将两个库中的总RNA平均分为6个不同的RNA测序试剂盒/条件，并在两个独立的位点重复构建文库。在样品制备后，我们使用Illumina的HiSeq2500平台进行了长RNA测序，以评估基因组和转录组定位百分比。
在比对之前，从每个样本fq数据中抽取50 million read pairs数据作为后续分析。
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比对率差异
- 比对到基因组，6种试剂盒在两个Pool中的唯一比对率相近：尽管OS试剂的唯一比对率最低；
- 比对到转录组时：TruSeq RNA Access kit_Frag或者_noFrag的比对率都是最高的，其他的都在∼50%甚至以下。
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RNA biotypes差异
在比对到转录组时，我们查看了四种RNA biotypes定量结果：protein-coding, lncRNAs, ncRNAs, and pseudogenes
- SMARTerPicov2和SMARTer/KapaHyper(Frag和FragRibo)试剂盒在整个Pool中的lncRNA Counts和TPM比例更高，
- 正如预期的那样，由于其捕获探针的设计，RNA Access试剂盒在通过Counts和TPM进行分析时，显示出蛋白质编码RNA的百分比最高
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- 与所有其他试剂盒相比， the SMARTer Pico V2 with Fragmentation and Ribosomal RNA depletion (SMART_Pico_Frag)表现出最高的唯一转录数量(154,942)
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评估试剂盒的重复性
- 使用DESeq2-normalized counts对all pools计算Spearman相关性：所有的试剂盒在site内和site之间都具有相当的重现性，除了Ovation_SoLo_Frag和SMART_KAPA_FragRibo试剂盒的重现性较低
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文章小结：评估指标基因组/转录组的reads（%）、检测到的基因数量、长RNA转录本多样性和可重复性方面的差异
