本期选择几篇有代表性的应用微量/单细胞DNA甲基化组学研究发表的SCI期刊论文，看看科研专家们是如何利用珍稀样本发表高分DNA甲基化研究文章的（物种涵盖人、猴、水牛、猪、小鼠等）。

01：  DNA甲基化测序助力人多能干细胞向胚胎全能8细胞的人工诱导

Rollingback human pluripotent stem cells to an eight-cell embryo-like stage

发布平台：Nature

发表时间：2022年3月

技术平台：RRBS、微量WGBS、scRNA-seq、scATAC-seq、SMART-seq2等单细胞测序技术

单细胞测序分析确定了与这种转化相关的基因网络和关键调控因子。在这个转化过程中，DPPA3和TPRX1基因起到关键作用：DPPA3基因在整个8CLC转化过程中诱导DNA去甲基化，TPRX1是8CLC基因网络的关键调控因子。

图1始发态PSC在4CL、阶梯e4CL和直接e4CL培养基形成naïve PSC和8CLC的示意图

DNA甲基化是基因表达的重要调控因子，在早期胚胎发育、始发态向原始态多能干细胞转化过程中，DNA甲基化将发生显著动态改变。已有研究报道，人工诱导过程DNA大范围的去甲基化与基因组稳定性的风险增加密切相关。研究者通过与胚胎发育8细胞DNA甲基化对比，探究e4CL培养基用于8CLC细胞转化过程中，原始多能和全能性基因的甲基化变化情况。

首先，对始发态PSC、4CL 12天培养的原始态PSC和进一步e4CL 5天培养，以及直接e4CL 7天培养的细胞进行简化基因组甲基化测序。结果显示4CL 12天培养的原始态PSC甲基化水平比始发态PSC甲基化水平更低（图2a），且与各种已发表的诱导技术相比，4CL 12天培养的原始态PSC基因组印迹位点与胚胎内细胞团 (ICM) 相似性程度更高（图2b） 。直接e4CL 7天培养细胞甲基化水平与胚胎8细胞甲基化水平相似（图2a）。

图2、简化基因组甲基化对不同培养条件细胞整体甲基化检测（a）及印记基因CG甲基化检测（b）. 

此外，通过对8CLC细胞，4CL 12天培养原始PSC细胞以及始发态PSC细胞进行全基因组单/微量细胞甲基化测序，结果显示，8CLC甲基化水平比4CL 12天培养的原始PSC或始发态PSC细胞甲基化水平更低，跟8细胞胚胎甲基化水平相当（图3a）。转录起始位点、gene bodies和特定基因元件（如增强子、CG岛、LTR、SINE、LINE、intergenic和intragenic等），8CLC甲基化水平也同样比4CL 12天培养的原始PSC或始发态PSC细胞甲基化水平低（图3b，c）。

图3、始发态PSC、4CL和8CLC微量/单细胞全基因组甲基化测序甲基化水平分析 

无论是简化基因组甲基化测序结果还是微量细胞全基因组甲基化测序，原始多潜能基因和全能基因甲基化水平都保持相对一致水平(图4)。

图4、全基因组甲基化测序分析原始多潜能基因（蓝色）和全能基因（红色）甲基化状态改变

为进一步探索8CLC细胞形成分子机制，研究者分析了不同细胞状态的基因表达差异，发现449个基因表达在8CLC中上调，几乎无下调基因。其中DPPA3和TPRX1基因处于上调前五基因内。已知DPPA3与UHRF1及DNMT1作用，控制小鼠卵母细胞被动去甲基化过程。DPPA3也通过调控印记基因甲基化修饰，参与到小鼠体细胞重编程过程。作者敲除DPPA3基因阻断了始发态PSC细胞向原始态PSC细胞的转化。敲除TPRX1基因阻断了阶段式e4CL和直接e4CL诱导8细胞胚胎标志物的形成，但是对4CL 12天培养原始态PSC的形成影响不大。与上述结果相对应，DPPA3基因敲除后，4CL 12天和e4CL直接7天细胞基因组DNA甲基化整体升高（图5a）。DPPA5和KHDC3L等原始多潜能基因，以及TPRX1和TRIM43等全能基因转录起始位点区域DNA甲基化在DPPA3敲除后都升高（图5b-d）。DPPA3敲除后，基因间区DNA甲基化同样升高（图5e），提示其作为远端调节区域和3D染色质相互作用的潜在位点 。表明8CLC转化过程中细胞功能和基因调控网络的重组发生了重大变化。

图5、DPPA3基因敲除后不同细胞甲基化变化

02：微量DNA甲基化测序助力中国科学家成功构建胚胎干细胞嵌合体猴，登上《细胞》封面

Live birth of chimeric monkey with high contribution from embryonic stem cells (高比例胚胎干细胞贡献的出生存活嵌合体猴)

发布平台：Cell

发表时间：2023年11月

北京时间2023年11月9日，《Cell》期刊以封面文章的形式在线发表了题为《Live birth of chimeric monkey with high contribution from embryonic stem cells》(高比例胚胎干细胞贡献的出生存活嵌合体猴)的研究论文，该研究在国际上首次成功构建了高比例胚胎干细胞贡献的出生存活嵌合体猴，并证实了猴胚胎干细胞可以高效地贡献到胚外胎盘组织和生殖细胞。

首先，研究者首先利用之前报道的人类原始造血干细胞(ESC)的提取方案，从17个E7(胚胎第7天)扩增囊胚中建立了9个猴原始造血干细胞系。之后选择了四种人类多能干细胞(PSC)培养基进行原始细胞到多能干细胞的转化：RSeT(基于NHSM24)、5iLAF、PXGL和4CL。此外，此研究还引入了LCDM，它可产生人类扩展潜能干细胞，这是一种分化能力更强的PSC。在每种条件下，此研究使用了5个引物猴ESC株系(2个雄性和3个雌性)进行转化。所有条件下的克隆均在2-4个传代内都出现了圆顶形形态(类似小鼠原始态胚胎干细胞)，但RSeT的形态变化较小，且使用4CL、RSeT和LCDM可将全部5个引物猴ESC株系成功转化为稳定的PSC，且经过20多次传代后表现出稳定的菌落形态。定量RT-PCR(RT-qPCR)分析表明，所有转化的ESC株系都表达经典的多能基因，其水平与原始ESCs相当。在所有转化的ESCs中，原始多能性基因的表达水平都不同程度地高于原始ESCs，其中在5iLAF和4CL培养的细胞中表达水平最高。KLF17、SOX2和NANOG的免疫染色进一步证实了这些发现。

此外，经RNA测序(RNA-seq)检测，在所有转化的ESC中，多个原始ESC富集基因下调，而在4CL和5iLAF ESC中，原始多能性网络被更强地激活。基因本体(GO)分析显示，在4CL和5iLAF ESCs中，与干细胞群体维持和DNA修饰相关的基因表达丰富，而在PXGL ESCs中，轴突导向和神经分化相关基因表达丰富。这些结果表明，4CL和5iLAF ESCs的原始状态稳定，但PXGL ESCs的幼稚状态不稳定，这反映了物种对这种培养基反应的特异性差异。然后，此研究通过基于液滴的单细胞RNA测序(scRNA-seq)研究了猴子的原始ESCs和在4CL、5iLAF和PXGL培养的ESCs的发育状态。相关性分析和均匀流形近似与投影(UMAP)显示，4CL和5iLAF ESCs更接近于ICM和植入前的上胚层，primed ESCs更接近于植入后晚期的上胚层，而PXGL ESCs则同时位于这两个分组中(图1)。

图1 在指定条件下培养的ESCs的免疫荧光图像以及原始多能性基因的表达水平和相关性特征。

由于DNA去甲基化是一种表观遗传学机制，通过这种机制，原始ESC可转化为幼稚多能状态，因此研究进行了微量DNA全基因组亚硫酸氢盐测序(Micro-WGBS)。结果表明，在RSeT、PXGL和LCDM中培养的ESCs的DNA甲基化水平较高(83%-86%)，与原始ESCs的水平相似；4CLESCs的水平较低(72%)，而5iLAFESCs的水平最低(52%)，4CL和5iLAFESCs显示的印记基因DNA甲基化模式与ICM更为接近(图2)。

图2 在不同条件下以及不同培养期猴ESCs的表观基因组特征

此研究还在4CL原始转化的不同阶段进行了全基因组甲基化分析，发现包括原始多能基因位点(KLF17、DPPA3和DNMT3L3)在内的所有基因组元件都出现了渐进的DNA去甲基化现象。另外，在4CL原始转换的不同时期进行了甲基化测序，发现包括原始多能基因位点(KLF17、DPPA3和DNMT3L3)在内的所有基因组元件都出现了逐渐的DNA去甲基化过程。此外，在转化过程中，一些印记基因的启动子区域也检测到了动态去甲基化(图3)。

图3 在1、3、7和10个传代的原始条件和4CL原始条件下培养的ESC，在不同基因组区域，原始多能基因，原始多能性位点以及印记基因启动子区域的DNA甲基化水平。

以上研究证明了与在其他人类造血干细胞培养基中培养的猴子造血干细胞相比，4CL造血干细胞显示出更均衡的全基因组DNA去甲基化，同时具有原始多能基因的高表达水平和基因组稳定性。

为了提高注射早期猴胚胎中ESC的存活率，此研究对4CL造血干细胞的培养方案进行了优化并将体外培养干细胞注射到早期胚胎中形成嵌合猴胚胎，移植到代孕雌猴体内，成功培育出了活产嵌合体。在确认代孕雌猴怀孕的12例妊娠中，有4例流产胎儿和6例足月活产后代，其中包含一个流产的男胎(9号)和一个活产的男胎(10号)。而DNA甲基化水平异常是导致小鼠嵌合不良的一个众所周知的原因，为了深入了解9号嵌合猴流产和10号活产嵌合猴健康受损的情况，此研究选择ESC分化的和宿主胚胎分化的GFP序列信号阳性(GFP+)和GFP序列信号阴性(GFP-)的-成纤维细胞和骨髓细胞(BMCs)进行了微量全基因组甲基化测序(Micro-WGBS)以研究表观遗传学状态。GFP+BMCs的DNA甲基化水平(约80%)高于GFP-BMCs(约72%)这种高甲基化分布在不同的基因组区域。在GFP+和GFP- BMCs之间共鉴定出18,462个不同的甲基化区域，显示出高甲基化(hyperDMRs)，其中9%在启动子区域，870个显示出低甲基化(hypoDMRs)。对这些hyperDMRs对应的基因进行的GO分析表明，这些基因富集于与发育相关的生物过程，如解剖结构形态发生和系统发育。在与BMC相关的发育术语方面没有观察到实质性的富集。BMC中前100个表达基因启动子中的DNA甲基化水平在GFP+和GFP-BMC之间无显著差异。这些发现与GFP+和GFP- BMCs的单细胞转录组分析结果相当相似。此研究还分析了印记基因的DNA甲基化水平，发现GFP+BMCs印记基因启动子区的DNA甲基化水平略高。同时，此研究发现这些印记基因在GFP+和GFP-BMCs中的表达水平相似，这表明在用4CL ESCs生成的猴嵌合体中没有明显的基因组印记缺失，且与此研究观察到的猴原始ESCs中的DNA甲基化水平大大高于ICM中的DNA甲基化水平是一致的（图4）。

图4 GFP+BMC和GFP-BMC整体、TSS,TES，不同基因组区域的DNA甲基化水平以及GFP+BMC在整个注释基因组中高甲基化区域分布，启动子区域DNA甲基化水平与BMC表达基因与印记基因的表达水平聚类热图 

03：微量细胞样本Micro DNA-BS绘制猕猴植入前胚胎发育中的DNA甲基化图谱

标题：De novo DNA methylation during monkeypre-implantation embryogenesis.

期刊：Cell Research

发表时间：2017.04.27

灵长类动物胚胎发育的关键表观遗传调控主要基于DNA甲基化水平的变化。本研究使用Micro DNA-BS对猕猴早期胚胎发育过程的5mC进行单碱基分辨率、高覆盖率的甲基化分析。分析结果鉴定了发育过程中的全基因组DNA去甲基化和从头甲基化，特别是在从2细胞到8细胞阶段的过渡期间，研究首次全面阐明了DNA甲基化动力学的“兴衰”。此外，DNA甲基转移酶敲降实验表明，异常的DNA甲基化会影响灵长类动物早期胚胎的正常发育。本研究结果进一步完善了目前关于哺乳动物DNA甲基化重编程的知识体系，并为未来灵长类动物胚胎发育的研究提供了宝贵的数据资源。

背景：

可能由于技术上的限制，还没有研究揭示早期胚胎发育过程中的全基因组DNA再甲基化。

方法：

在这项研究中，研究人员首先优化了基于转座酶的全基因组重亚硫酸盐测序（transposase-based tagmentation bisulfite sequencing）技术，实现了微量细胞（100个细胞）的全基因DNA甲基化测序（Micro DNA-BS）。基于这一技术，研究团队详细的研究了猕猴早期着床前胚胎的DNA甲基化动态变化过程。

结果：

研究发现猕猴早期胚胎发育过程中CpG位点的DNA甲基化动态变化存在着再甲基化的现象，特别是8细胞时期较为明显。有意思的是非CpG位点的DNA甲基化变化在合子期及桑椹胚时期也呈现出了再甲基化的特点。进一步的分析发现这一再甲基化过程是在全基因组水平同时伴随着DNA去甲基化过程发生的，DNA甲基化酶和去甲基化酶的时空特异性表达是造成这一现象的潜在机制。此外通过对前期已发表的人早期着床前胚胎DNA甲基化测序数据分析，研究人员还发现人早期胚胎发育时DNA去甲基化过程也伴随着再甲基化的现象。有意思的是，这一再甲基化过程在小鼠早期胚胎发育中并未观察到，这一结果表明DNA再甲基化可能在灵长类早期胚胎发育中是一个保守的机制。

图：猕猴早期胚胎发育过程中CpG位点的DNA甲基化动态变化

图：成对比较揭示植入前胚胎发育过程中全基因组DNA去甲基化和从头甲基化

图：猕猴和小鼠早期胚胎发育中的再甲基化过程交叉比较

结论：

论文首次揭示了灵长类动物早期着床前胚胎发育中的DNA再甲基化过程，并表明DNA甲基化酶和去甲基化酶的时空特异性表达是造成这一现象的潜在机制。该工作修正了之前一直认为的哺乳动物早期着床前胚胎发育只存在去甲基化过程而不存在再甲基化过程的认识。该项研究为重新认识灵长类早期胚胎发育的DNA甲基化重编程及生殖受精事件提供了新的思路。

04：单细胞DNA甲基化与转录组分析揭示猪生发泡卵母细胞成熟的关键调控机制

标题：Single-cell multi-omics profiling reveals key regulatory mechanisms that poise germinal vesicle oocytes for maturation in pigs（单细胞多组学分析揭示了猪生发泡卵母细胞成熟的关键调控机制）

发表期刊：Cellular and Molecular Life Sciences

发表日期：2023年07月22日 

本研究以青春期母猪卵巢不同大小窦卵泡中的卵母细胞为研究对象，采用单细胞M&T-seq技术（scWGBS + Smart -seq2）对62个卵母细胞的细胞核DNA甲基化组和细胞质转录组进行平行分析。同时利用10×单细胞转录组分析了窦卵泡内细胞间互相交流机制。本研究开发了methyConcerto分析包以专门和全面表征单细胞甲基化谱和等位基因特异性甲基化。对猪窦卵泡中单个卵母细胞的基因表达和DNA甲基化进行了表征，活性和非活性基因体都显示出高甲基化水平，从而定义为两种不同类型的卵母细胞。尽管II型卵母细胞甲基化水平高于I型，但II型的细胞质转录本数量是I型的近两倍。此外，II型卵母细胞的印迹甲基化模式差异比I型大，II型卵母细胞的基因表达和DNA甲基化与MII卵母细胞更相似。粒细胞和II型卵母细胞之间的串扰活跃，这些观察结果表明II型卵母细胞更容易成熟。最后通过体外成熟实验进一步验证了胰岛素信号通路中的胰岛素受体底物-1（IRS1）是成熟的关键调控因子。本研究为哺乳动物卵母细胞减数分裂停滞和减数分裂恢复之间的调控机制提供了新的见解，同时还为未来的单细胞甲基化组学研究提供了新的分析包。

猪卵母细胞DNA甲基化谱

II型和I型卵母细胞的差异性等位基因特异性甲基化

05：植入前胚胎的全基因组DNA甲基化和转录组分析揭示水牛胚胎基因组激活进展

标题：Whole-genome transcriptome and DNA methylation dynamics of pre-implantation embryos reveal progression of embryonic genome activation in buffaloes（植入前胚胎的全基因组转录组和DNA甲基化动态变化揭示了水牛胚胎基因组激活进展）

发表期刊：Journal of Animal Science and Biotechnology   

发表日期：2023年07月11日 

在哺乳动物植入前胚胎发育（PED）过程中，母源-合子转换（MZT）过程通过表观遗传修饰和基因表达来调控，并与胚胎基因组激活（EGA）有关。在MZT期间，胚胎对环境敏感，易在体外停滞。然而，水牛EGA的发生时间和调控机制尚不清楚。

本研究对水牛植入前胚胎进行基于单细胞的RNA-seq和全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS），以绘制转录组和DNA甲基化图谱。水牛PED过程中分为四个典型的发育阶段。通过基因表达和DNA甲基化变化综合分析，在16细胞期鉴定出水牛的主要EGA。通过加权基因共表达网络分析（WGCNA）揭示了水牛母源-合子转换过程中的阶段特异性模块，并进一步揭示了关键信号通路和生物过程事件。这些通路的程序化和持续激活促进了水牛EGA成功。此外研究结果还表明hub基因CDK1在水牛EGA中起关键作用。本研究绘制了水牛PED中的转录组和DNA甲基化图谱，并深入揭示了水牛EGA的分子机制和水牛MZT期间的遗传编程，这将为改善水牛胚胎的体外发育奠定基础。

水牛PED过程中的DNA甲基化图谱

利用WGCNA进行阶段特异性基因共表达分析

MZT过程中关键hub基因的鉴定。

06 ：微量DNA甲基化分析揭示MeCP2在卵子发生和卵巢衰老中的表观遗传调控

标题：CRL4DCAF13 E3 ubiquitin ligase targets MeCP2 for degradation toprevent DNA hypermethylation and ensure normal transcription in growing oocytes

时间：2024.04.05

期刊：Cellular and Molecular Life Sciences

本研究通过对野生型ICR小鼠和转基因小鼠的一系列比较分析结果表明，MeCP2蛋白在原始卵泡和初级卵泡中高表达，但在次级卵泡中几乎检测不到。但在衰老卵巢中，卵母细胞和颗粒细胞中的MeCP2蛋白显著增加。生长中的卵母细胞中的MeCP2过表达会导致转录失调、DNA高甲基化和基因组不稳定，最终导致卵泡生长停滞和凋亡。DCAF13是Cullin 4-RING（CRL4）E3连接酶的底物识别接头，可以靶向MeCP2，并在细胞和卵母细胞中被多泛素化以进行降解。Dcaf13基因敲除的卵母细胞表现出MeCP2蛋白积累，并且在MeCP2敲低后部分挽救了由Dcaf13缺失诱导的卵泡生长停滞。RNA-seq结果揭示生长中的卵母细胞中，大量基因受DCAF13-MeCP2轴调控。本研究表明，CRL4DCAF13 E3泛素连接酶靶向MeCP2进行降解，以确保生长中的卵母细胞中正常的DNA甲基化和转录。此外，在衰老的卵泡中，观察到DCAF13和DDB1蛋白的死亡，表明了一种潜在调控卵巢衰老的新机制。

MeCP2在生长中的卵母细胞中过表达导致CpG岛的DNA高甲基化

DCAF13-MeCP2轴异常导致生长中的卵母细胞基因表达异常

参考文献：

1）MazidMA, Ward C, Luo Z, Liu C, Li Y, Lai Y, Wu L, Li J, Jia W, Jiang Y, Liu H, Fu L,Yang Y, Ibañez DP, Lai J, Wei X, An J, Guo P, Yuan Y, Deng Q, Wang Y, Liu Y,Gao F, Wang J, Zaman S, Qin B, Wu G, Maxwell PH, Xu X, Liu L, Li W, Esteban MA.Rolling back human pluripotent stem cells to an eight-cell embryo-like stage.Nature. 2022 May;605(7909):315-324. pii: 10.1038/s41586-022-04625-0. doi:10.1038/s41586-022-04625-0. PubMed PMID: 35314832.

2）Cao,Jing, Wenjuan Li, Jie Li, Md. Abdul Mazid, Chunyang Li, Yu Jiang, Wenqi Jia, etal. 'Live Birth of Chimeric Monkey with High Contribution from Embryonic StemCells'. Cell 186, no. 23 (November 2023): 4996-5014.e24.https://doi.org/10.1016/j.cell.2023.10.005.

3）Gao F,Niu Y, Sun YE, Lu H, Chen Y, Li S, Kang Y, Luo Y, Si C, Yu J, Li C, Sun N, SiW, Wang H, Ji W, Tan T. De novo DNA methylation during monkey pre-implantationembryogenesis. Cell Res. 2017 Apr;27(4):526-539. pii: cr201725. doi:10.1038/cr.2017.25. PubMed PMID: 28233770.

4）Yuan X,Chen N, Feng Y, Li N, Pan X, Tian Y, Wang J, Jiang Y, He D, Li J, Gao F.Single-cell multi-omics profiling reveals key regulatory mechanisms that poisegerminal vesicle oocytes for maturation in pigs. Cell Mol Life Sci. 2023 Jul22;80(8):222.

5）Fu P,Zhang D, Yang C, Yuan X, Luo X, Zheng H, Deng Y, Liu Q, Cui K, Gao F, Shi D.Whole-genome transcriptome and DNA methylation dynamics of pre-implantationembryos reveal progression of embryonic genome activation in buffaloes. J AnimSci Biotechnol. 2023 Jul 11;14(1):94.

6）Ren P,Tong X, Li J, Jiang H, Liu S, Li X, Lai M, Yang W, Rong Y, Zhang Y, Jin J, MaY, Pan W, Fan HY, Zhang S, Zhang YL. CRL4DCAF13 E3 ubiquitin ligase targetsMeCP2 for degradation to prevent DNA hypermethylation and ensure normaltranscription in growing oocytes. Cell Mol Life Sci. 2024 Apr 5;81(1):165. pii:10.1007/s00018-024-05185-4. doi: 10.1007/s00018-024-05185-4. PubMed PMID:38578457.