本文选自nature communication，https://doi.org/10.1038/s41467-019-13571-x，喜欢的朋友可以自行下载阅读。
不废话，上图。
先看一个结论：雌激素是肝脏中促转移免疫微环境的调节剂，也是治疗肝转移疾病的潜在靶点。
摘要：这里探讨了在调节结肠癌和肺癌LM的肿瘤免疫微环境（TIME）中观察到的一种性别二型性，其中雌性小鼠LM的髓源性抑制细胞（MDSC）和调节性T细胞的积聚是tnfr2依赖的，而雄性小鼠则不是。在去卵巢小鼠中，大肠癌、肺癌和胰腺癌LM明显减少，雌二醇重建可逆转。这与肝MDSC积聚减少、CD8+T细胞γ-干扰素（IFN-γ）和颗粒酶B生成增加以及TNFR2、IDO2、TDO和SerpinB9表达水平降低有关。三苯氧胺治疗可增加肝细胞毒性T细胞的积累，减少结肠癌LM。
本文基于作者前期的工作基础，就是发现了TNFR2在雌性小鼠可以诱导转移免疫微环境从而促进肿瘤转移的过程。当在雄性小鼠中评估LM时，在通过脾内/门静脉途径将年龄匹配的TNFR2阴性小鼠与结肠癌MC-38细胞接种后，我们发现这些小鼠的肝转移数量与WT对照组没有显著差异。
作者在雄性小鼠中发现肿瘤周围存在MDSC浸润，但是与野生型相比，TNFR2-/-并未见明显差异，并且流式细胞分析发现MDSC在免疫细胞的比例未见改变。在雄性WT小鼠中，表达TNFR2的CD11b+Gr-1+细胞的比例（30-40%）明显低于雌性小鼠（75-90%）。
为了进一步探讨雄性和雌性小鼠的TIME差异，首先比较了荷瘤雄性和雌性小鼠在接种MC-38细胞后7天通过脾内/门静脉途径肝脏中HIC的比例积累。FC显示，从雄性小鼠收集到的HIC总数是从雌性小鼠收集到的总数的1.68倍，这可能是由于雄性肝脏的体积按比例增大。HIC免疫表型显示，雄性小鼠的G-MDSC（CD11b+Ly6GHighLy6CMid）【M-MDSC（CD11b+Ly6CHighLy6GMid）】的平均每肝比例比雌性小鼠高4倍，雌性MDSC上TNFR2的表达显著（3倍）高于雄性MDSC，雄性和雌性小鼠肝脏中的T淋巴细胞平均数量没有显著差异，尽管雌性小鼠肝脏中的NK细胞数量有所增加。这些数据表明，雄性和雌性小鼠在LM期的骨髓细胞募集可能受到不同的调节。
作者进一步研究了激素调节在调控LM相关免疫微环境中的作用.雌性C57BL/6小鼠通过手术切除卵巢（OVX）来降低循环雌激素水平。卵巢切除术后3周证实子宫重量减轻，表明生理性激素水平下降。然后通过脾内/门静脉途径注射MC-38或（肺癌）H-59细胞，在OVX和假手术对照小鼠中产生实验性LM。此外，胰管腺癌（PDAC）的自发性转移是由胰内注射10e6 LMP细胞引起的。（选择这些肿瘤模型是因为它们高度转移到肝脏，代表性激素无关的组织肿瘤类型，并且在疾病的临床过程中转移到肝脏）15-30天后处死小鼠并计数LM。与假手术对照组相比，在所有三组中，我们观察到OVX小鼠肝转移的数量显著减少。石蜡包埋肝切片证实OVX小鼠LM数量和大小减少
胰腺内注射LMP的原位肿瘤重量没有差异。这些数据表明卵巢性激素促进雌性小鼠结肠癌、肺癌和胰腺癌。
作者进一步研究了雌激素所致的转移是不是有器官特异性，用尾静脉注射的方法制造实验性肺转移和肝转移，结果发现下图，所以说，雌激素所致转移具有器官特异性，这让我想起了TIMP-1这个特异性肝转移指标。
卵巢切除并没有降低TNFR2-/-小鼠实验性肺转移的发生率，也没有减少TNFR2-/-小鼠肺转移的数量，这表明肝脏中卵巢激素促进肿瘤生长的作用可能与TNFR2信号有关。
作者下一步分析了卵巢雌激素对于LM转移的影响。在接种MC-38细胞前1周皮下植入含有17β-E2的硅橡胶胶囊的OVX小鼠，并在肿瘤接种后15天分析LM。酶联免疫吸附试验（ELISA）证实，尽管大多数OVX小鼠的血清E2浓度低于检测水平，但植入β-E2胶囊的OVX小鼠的血清E2浓度恢复到正常范围。重组E2可将肝转移瘤的数量恢复到对照水平，将其确定为对肝转移瘤生长最关键的雌激素。
雌激素对肿瘤生长什么作用呢，作者进一步作了MTT实验。β-E2对MC-38没有显著影响，LMP或H-59细胞在任何使用浓度下或在任何时间点（24、48和72小时）被检测到增殖，尽管在类似条件下，β-E2确实将作为阳性对照的雌激素依赖性MCF-7细胞的增殖增加到与10%FBS完全培养基相似的水平。
既然作者都做到这个地步了，下面就开始主角登场了，骨髓间充质干细胞是一种异质性的CD11b+Ly6C+Ly6G+髓样细胞群，它们在肿瘤生长部位发挥免疫抑制功能，包括抑制CD8+细胞毒性T细胞（CTL）和Treg的募集，基于前期实验结果，作者进一步看看OVX是不是抑制了MDSC的招募。在接种MC-38后7d处死OVX和对照组小鼠，用FC和定量实时逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）分离和分析HIC。基因表达分析首先证实肿瘤浸润性T细胞和MDSCs表达ERα。
OVX小鼠肝脏中CD11b+Ly6C+Ly6G+的积累减少了2倍，这主要是由于G-MDSC（CD11b+Ly6CMidLy6GHigh）群体的显著减少
这些细胞都存在于微转移的边缘，并且在OVX小鼠中显示出减少积聚的趋势。这对应于相同边缘内CD8+T细胞数量的增加，没有观察到NK细胞积累的显著差异，但我们确实观察到雌激素缺乏小鼠CD11c+细胞积累的减少，此外，在OVX小鼠的肝脏中观察到肿瘤相关的F4/80+巨噬细胞显著减少，已知它们在LM进展30中起重要作用（会不会是MDSC的成熟在雌激素作用下受到了抑制）。
安利一个CD11家族标记的细胞类型：CD11a：Positive staining (normal): all leukocytes CD11B: 单核细胞，巨噬细胞，中性粒细胞，NK细胞等；
CD11C：树突细胞，单核细胞，巨噬细胞，中性粒细胞。
这种免疫细胞浸润类型是不是肿瘤特异性的呢，作者分别注射了肺和胰腺细胞进行研究。通过脾内/门静脉途径给OVX小鼠注射H-59肺癌和LMP-PDAC细胞，并通过FC分析TIME的组成
这些数据表明雌激素是肝转移疾病发生TIME的一个重要的多功能调节因子。在移植LMP细胞的OVX小鼠胰腺中，G-MDSC和CD8+CTL在胰腺肿瘤中的蓄积与假手术组和雌激素恢复组相比无显著性差异.与肝脏TIME相比，我们发现在胰腺中几乎没有Ly6CHighM-MDSC的积聚。在静脉注射H-59细胞的小鼠肺中，在雌激素缺乏的情况下，CD8+CTL的积累没有变化。
OVX对肺M-MDSC的积累无明显影响，而G-MDSC在肺组织中的积累可忽略不计。这些发现共同揭示了荷瘤小鼠肺、胰腺和肝脏中骨髓细胞积聚的器官特异性差异。
活化的CD8+T淋巴细胞是适应性抗肿瘤免疫反应的主要介质，其特征是产生干扰素γ（IFN-γ）。为了确定雌激素是否影响肝脏中T细胞的活化和细胞因子的产生，在体外用PMA and ionomycin刺激后，测定了从接种MC-38的OVX和假对照小鼠肝脏中分离的CD3+CD8+T细胞中IFN-γ的水平。流式细胞术分析显示，与对照组相比，从OVX小鼠分离的T细胞产生IFN-γ增加了2倍，表明CTLs免疫应答增强。granzyme B（GrzB）mRNA在这些细胞中的表达增加证实了FC的发现。由于雌激素缺乏并没有显著改变Foxp3+细胞的数量，活化T细胞的比例增加可能导致这些小鼠肝脏中更有效的抗肿瘤免疫反应。(为什么用PMA and ionomycin刺激：1.PKC属于下游的TCR信号，只会诱导T细胞活化和增殖，因此，PMA和Ionomycin的刺激后T细胞的活化和增殖能力改变，然而并不会改变T细胞的分化状态。2.TCR信号的活化会激活所有的T细胞亚群，所以当T细胞不同亚群的增殖速率不一样时，各个T细胞亚群的原始比例就会因为刺激而发生改变。但是这种假说很难加以证明，因为在没有刺激的情况下，胞内因子很难被检测到。3.因为TCR信号是很强很基础的刺激，研究者更加倾向于认为所有的T细胞亚群在TCR信号刺激下的增殖速度是一致的，所以在在体外进行PMA和Ionomycin刺激后，仍然反映的是T细胞亚群在生物体体内的原始比例。)，由此可见雌激素抑制了CD8+T活化，活化T细胞的比例增加可能导致这些小鼠肝脏产生更有效的抗肿瘤免疫反应。（盲猜作者会用PD-1）
SerpinB9(GrzB的抑制剂)、吲哚胺-2，3-双加氧酶(IDO)和色氨酸-2，3-双加氧酶(TDO；色氨酸分解代谢酶)是妊娠期间雌激素水平升高高度诱导的免疫抑制蛋白，以保护发育中的胎儿免受母体同种异体T细胞的影响。这些蛋白也可以由肝细胞和肿瘤相关的树突状细胞表达，并与对恶性肿瘤细胞34-36的免疫耐受有关。我们用qRT-PCR检测了它们在肝脏中的表达水平，并观察到OVX小鼠SerpinB9、IDO2和Tdo的表达降低了2倍以上，这表明雌激素参与了它们在肝脏中的表达调节。
作者既往发现TNFR2是雌性小鼠肝脏中的免疫抑制调节因子(即MDSC存活和功能），进一步研究TNFR2的表达以及对肿瘤坏死因子-α的反应是否受雌激素的调节。对浸润性MDSCs和Tregs进行分离和免疫表型分析。与对照组相比，从去卵巢小鼠分离的单核细胞MDSCs(CD11b+Ly6CHighLy6GMid)和CD4+CD25+Foxp3+细胞中TNFR2的表达显著降低，这可能是导致MDSC积聚减少和雌激素耗竭小鼠T细胞活化增加的原因。
从WT雌性小鼠收集的脾细胞经10−7Mβ-E2体外处理后，TNFR2 mRNA的表达比赋形剂处理的对照组增加了3.5倍.来自OVX小鼠的LM浸润的Treg细胞的IDO1表达显著降低(图7G)，证实了一种解除调节的功能。
作者还发现雌激素耗竭的OVX小鼠增加了DC的激活，这与更强大的抗肿瘤免疫是一致的。
为了确定卵巢切除是否也影响肝源性MDSC的功能，从而控制T细胞的expansion，作者进行了一项以脾脏CD3+T细胞为靶点的抑制试验。发现，与来自OVX小鼠肝脏的MDSC共孵育的T细胞比从假手术或OVX+E2肝脏获得的MDSC孵育的T细胞具有更好的增殖能力。这证实了肝源性MDSC的免疫抑制功能，表明雌激素剥夺不仅改变了MDSC进入肝脏的动员，而且改变了它们的抑制功能。
为了确定这些综合作用是否降低了转移细胞在肝脏中增殖的能力，我们测量了肿瘤细胞中Ki-67的表达。总而言之，这些结果强烈暗示雌激素参与调节多种因素，包括TNFR2的表达，这些因素可以促进肝脏的TIME。
既然雌激素作用这么好，那么家用雌激素抑制剂会对肿瘤肝转移起到抑制作用吗？给小鼠注射MC-38细胞，然后每周三次皮下注射4-羟基三苯氧胺或油作为载体。21d后处死小鼠，计数LM。在服用TMX的动物中，观察到与对照组相比，LM的数量显著减少且呈剂量依赖性。在服用Tmx的小鼠中，肝脏MDSC的平均数量减少，从其肝脏提取的CTL中干扰素-γ的产生水平相应增加2倍。这表明这些小鼠的抗肿瘤T细胞免疫增强。
全文结束，本文只是免疫相关的表型实验，没有牵涉到机制部分，如果有兴趣的同学可以进一步探讨这其中DC活化或者MDSC动员所包含的机制问题，本文偏基础，没有临床数据是这篇文章最大的败笔，如何能让读者觉得这篇文章是紧密联系临床的呢？并没有，本文明面有任何关于生存的图，说明了什么呢？如果最后在他莫昔芬+PD-1在肿瘤治疗中用一用的话会不会对文章有点提升呢？欢迎批评、指正。
安利一个自发胰腺癌肝转移实验：Spontaneous PDAC LM：将1×106LMP细胞植入25µLMatrigel(纽约州康宁，美国)混合25µL磷酸盐缓冲盐水(PBS)的胰腺内，观察到自发性PDAC肝转移。简而言之，B6.129小鼠用异氟醚麻醉。局部剃须消毒后，在左上腹作1.5cm纵向切口切开腹腔。将体积为50µL的冰冷Matrigel/癌细胞混合物缓慢注射到胰腺实质的尾部，使用冰冷的27号针头和冰冷校准的注射器。拔针前将针头留在注射部位30s，以防渗漏。肿瘤植入后21-30天，动物被安乐死，此时肝脏表面可见转移灶。做肝转移有福气了。
