星形胶质细胞作为大脑中最丰富的神经胶质细胞，在调节神经元功能和可塑性中发挥关键作用，其基因表达异常与阿尔茨海默病等神经退行性疾病密切相关。复杂性状相关的遗传变异常位于远端增强子区域，但这些增强子在特定细胞类型中的功能状态及靶基因仍不明确。新南威尔士大学生物技术与生物分子科学学院、细胞基因组未来研究所和RNA研究所团队通过CRISPRi（干扰）文库筛选结合单细胞RNA测序，构建了人类原代星形胶质细胞的增强子-基因调控资源库，揭示了调控星形胶质细胞核心功能及AD相关基因的关键增强子。此类大规模、高通量的功能性基因组学研究，离不开成熟的CRISPR文库设计、构建与筛选服务平台的支持。在这方面，海星生物凭借其丰富的经验与技术积累，可为科研人员提供从sgRNA设计、慢病毒文库制备到功能性筛选验证的一站式解决方案，助力类似本研究的复杂调控网络解析工作。
一、研究方法
细胞模型：研究使用胎儿脑来源的正常人星形胶质细胞（NHA），并通过稳定表达dCas9-KRAB构建了用于CRISPRi筛选的细胞系。通过转录组和染色质可及性分析，证实该细胞系保持了胎儿期星形胶质细胞的特征（图1b,c）。
候选增强子筛选：从PsychENCODE计划预测的脑活跃调控区域出发，结合NHA自身的ATAC-seq数据（染色质开放区域）以及多个独立的星形胶质细胞/神经细胞ATAC-seq数据集，筛选出位于基因间区、在染色质开放状态且位于包含高表达基因的拓扑关联域（TAD）内的979个候选增强子区域（图1d-g）。
CRISPRi筛选与单细胞RNA测序：针对每个候选增强子，设计并合成了至少2条sgRNA，构建了包含2478条sgRNA的文库。以MOI=5将文库转导至NHA-dCas9-KRAB细胞中，7天后进行单细胞RNA测序（scRNA-seq）。通过分析每个增强子被抑制的细胞与对照细胞之间，在增强子500kb范围内所有基因的表达差异，来鉴定功能性的增强子-基因。
计算分析与模型构建：利用筛选获得的“金标准”数据（158对功能性EGPs），研究团队训练了一个新的随机森林预测模型——EGrf，用于在全基因组范围内预测星形胶质细胞中的增强子-基因调控关系。
多层次验证：对筛选得到的关键EGPs，使用NanoString数字RNA计数、qRT-PCR甚至蛋白质印迹（Western Blot）在不同细胞系中进行独立验证，确保了结果的可靠性。
二、核心研究结果解析
结果1：CRISPRi文库筛选鉴定星形胶质细胞功能性增强子-基因对
阳性对照中125个启动子中的122个被显著沉默，阴性对照未出现P值膨胀，证实筛选体系可靠（图1d、e）。
筛选鉴定出145个增强子调控116个基因，形成158个调控对，其中84.1%导致基因表达下调，平均绝对log2倍变化为0.22（图2a）；多数增强子调控单个基因，部分基因可被多个增强子调控，最多达5个增强子共同调控一个基因（图2b）。功能性增强子富集于K562细胞中经实验验证的增强子和星形胶质细胞超增强子区域，且EGPs极少跨越TAD边界，符合增强子调控的基因组特性（图2c）；NanoString验证20个调控对，18个显示显著效应，且与单细胞筛选结果高度相关（r=0.86）（图2d）。
结果2：功能性增强子的基因组与转录特征
50%的调控相互作用发生在50kb内，76%发生在200kb内，虽增强子调控最近基因的概率显著高于随机水平（OR=11.7），但仅38.6%的调控对靶向最近基因，29.1%的增强子会跳过高表达基因调控远端基因（图3a、b）；功能性增强子与转录活性密切相关，73.1%的功能性增强子存在转录活性，且更可能为双向转录（OR=1.8），转录水平显著高于非功能性候选增强子（图3c-e）；48%的功能性增强子在不同细胞类型中染色质状态存在显著差异，34%在细胞类型和发育阶段中均有差异，其中星形胶质细胞富集模块M3中的功能性增强子，其H3K27ac水平在星形胶质细胞中显著高于其他细胞类型（图3f、g）。
结果3：星形胶质细胞特异性调控网络解析
增强子调控基因显著富集于"趋化"、"细胞迁移"、"创伤响应"等星形胶质细胞核心功能（图4a），以及星形胶质细胞特异性、成熟调控、衰老相关和IL-1α+TNF+Clq诱导的激活相关基因，而管家基因显著匮乏（图4a、b）；功能性增强子更易被星形胶质细胞中表达的转录因子结合，83个转录因子在功能性增强子中结合富集（FDR<0.05），包括参与星形胶质细胞激活的FOXK1和介导星形胶质细胞成熟的RUNX2（图4c）。
构建包含18个星形胶质细胞特异性基因、19个星形胶质细胞特异性增强子及36个星形胶质细胞特异性转录因子的调控网络，72%的预测转录因子-增强子相互作用得到ChIP-seq数据支持，且均在星形胶质细胞富集组分中检测到（图4d、e）。
结果4：AD相关基因的增强子调控机制
增强子调控基因在AD相关基因集中显著富集，特别是在ROSMAP队列中，158个调控对中的100个涉及与AD神经病理或认知功能相关的基因（图5a、b）。
鉴定出调控LGALS3（编码Galectin-3，介导星形胶质细胞-小胶质细胞串扰）的三个增强子，其中两个具有星形胶质细胞特异性染色质开放状态；同时鉴定出调控11个其他AD差异表达基因的功能性增强子，这些增强子可为细胞特异性靶向调控提供靶点（图5b、c）。
通过NanoString验证16个调控AD相关基因的增强子，均证实其调控效应，包括三个调控LGALS3的增强子（图5c）。
结果5：非编码变异的功能注释与预测模型构建
研究者将CRISPRi发现的调控相互作用与多个大脑eQTL数据库（GTEx,mmQTL等）进行比较。结果发现，仅有17%的CRISPRi EGPs能被任何eQTL数据捕获；高达40%的情况下，eQTL将同一增强子与CRISPRi发现的不同基因相关联（图6b,c）。例如，调控星形胶质细胞关键基因ID3的两个增强子，虽被实验验证且位于超级增强子区，却未被任何大脑eQTL数据捕获（图6b）。这表明，CRISPRi功能筛选能揭示大量eQTL研究由于统计效力、细胞类型异质性或罕见变异等原因所遗漏的调控关系，为解读非编码区变异提供了宝贵的新资源。
基于CRISPRi筛选数据训练的EGrf模型，在星形胶质细胞中预测准确性（AUPRC=0.57）显著高于现有模型（如ABC、rE2G-DNase）；应用EGrf在全基因组范围内预测出1348个高特异性EGPs，其中5个预测调控AD相关基因的增强子经CRISPRi验证，4个证实有效（图7a-d）。
三、研究意义
该研究通过CRISPRi文库筛选首次构建了人类原代星形胶质细胞的增强子-基因调控资源库（AstroREG），揭示了星形胶质细胞特异性调控网络，鉴定出调控AD相关基因的关键增强子，为理解神经退行性疾病机制提供了全新视角。研究同时开发了适用于星形胶质细胞的增强子-基因预测模型，显著提升了细胞特异性调控关系的预测准确性，为非编码基因组功能注释提供了重要工具。
未来，在反应性星形胶质细胞、与神经元共培养的星形胶质细胞等不同功能状态下进行类似筛选，将进一步丰富我们对大脑基因调控网络的理解。此外，结合CRISPRa（激活）或碱基编辑等技术，将能更全面地解析增强子功能及特定序列变异的影响。海星生物作为基因编辑领域的专业服务商，拥有成熟的CRISPR-KO、CRISPRa、CRISPRi文库构建与筛选、敲除和点突变等经验，能够为神经科学、疾病机制等前沿研究提供从方案设计到数据产出的全方位技术支持，助力科学家更快、更准地解锁非编码基因组的奥秘。
参考文献：Green N F O, Sutton G J, Pérez-Burillo J, et al. CRISPRi screening in cultured human astrocytes uncovers distal enhancers controlling genes dysregulated in Alzheimer’s disease[J]. Nature Neuroscience, 2025: 1-14.
