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1 单个疾病分析
2 单个疾病结合免疫浸润，铁死亡，自噬等相关分析
3 两种相关疾病联合分析，包括非肿瘤结合非肿瘤，非肿瘤结合肿瘤或者非肿瘤结合泛癌分析
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研究背景：脓毒症是一种危及生命的综合征，其特征是感染后的器官衰竭，由宿主对感染的反应失调引起。在机体系统中，免疫系统在脓毒症的病理生理学中起着重要的作用。免疫基因组学和免疫细胞浸润在脓毒症中的影响仍未被系统地了解。鉴于早期疾病缺乏明显和非特异性的临床体征，早期诊断和适当的治疗对于改善患者的预后至关重要。在本研究中，基于RF和LASSO回归，识别了枢纽免疫相关基因(IRGs)，从而构建了一个预测模型。随后，在数据库的独立验证队列中测试该模型的预测和预后价值。最后，从多个角度系统地将IRG分类与免疫学特征相关联。
研究结果：
一、免疫相关差异基因（DEIRGs）和功能富集分析
1、如UpSet图(图1A)所示，在数据集GSE65682、GSE57065、GSE69528、GSE95233和IRG数据集中有59个DEIRGs重叠。图1B显示了59个DEIRGs在染色体上的位置。
2、DEIRGs的GO分析显示了前10个重要的富集组簇(图1C)，如T细胞活化、参与免疫应答的中性粒细胞活化等。
3、DEIRGs的KEGG分析，主要参与Th17细胞分化、细胞因子-细胞因子受体相互作用(CCR)等(图1D)。
二、鉴定中心IRGs和IRG分类器的构建
1、建立Lasso回归模型，缩小并发现队列中的中心IRG，如图2A和B所示。同样，对发现队列中的中心IRG建立最小误差回归树，如图2C和D所示。
2、根据队列中LASSO和RF的结果，取6个结果的交集，获得了≥4的8个枢纽基因(ADM、CX3CR1、DEFA4、HLA-DPA1、MAPK14、ORM1、RETN和SLPI)。
三、qRT-PCR验证hub基因表达
在50个临床标本中进行了qRT-PCR，与健康对照组相比，脓毒症样本中ADM、DEFA4，MAPK14，ORM1，RETN，SLPI显著上调；然而CX3CR1和HLA-DPA1显著降低（图2E）。
四、IRG分类器的诊断和预后价值
1、如图3a-d，IRG分类器的诊断能力显示出优越的诊断效率
2、在预后价值方面，单因素和多因素Cox回归分析证实，在多个转录组数据集中，IRG评分是不良生存结果的独立预测因子（表2）
3、如图3F，H，J和L，ROC分析调查发现IRG分类器在外部验证队列中显示出良好的预后能力。
4、在多个转录组数据集中，高危组患者的死亡率显著高于低危组（图3)。并且，IRG分类器在多个数据集中预测效果优良。（图4）
五、IRG分类器的临床应用价值
1、在IRG高危亚组中，使用氢化可的松，死亡风险增加相关。在IRG低风险亚组中，使用氢化可的松没有显著改变（表3）。
2、根据发现模型和外部验证队列结果，IRG分类器优于年龄、SRS、MARS和APACHE II。（图5）
六、免疫细胞浸润分析
1、CIBERSORTx结果表明，在低风险组中T细胞数量增加、NK细胞、单核细胞和肥大细胞活化明显。在高风险组中浆细胞，T细胞调节(treg)和静息肥大细胞更常见(图.6A)。
2、在E-MTAB-4421数据集中，CD8T细胞、静止NK细胞、单核细胞和激活树突状细胞在低风险亚组中更为丰富，而幼稚CD4T细胞、Treg和M0巨噬细胞在高风险亚组中更丰富(图6B)。
3、在E-MTAB-4451数据集中，与高危组相比，CD8T细胞、静息CD4记忆T细胞、活化NK细胞和活化肥大细胞在低风险组中更丰富，而幼稚CD4T细胞、Treg和静息肥大细胞在高风险组中更丰富(图6c)。
4、髓系来源的抑制细胞(MDSC)在高危组中比低危组更丰富（图7A）。在E-MTAB-4421(图7b)和E-MTAB-4451数据集(图7c)中也观察到类似的结果，表明IRG高危亚组患者具有免疫抑制的特征。
七、IRG分类器与免疫细胞的相关性
通过多基因表达谱中的Spearman相关性分析，进一步探讨IRG分类器是否与脓毒症中的免疫细胞浸润相关。在GSE65682数据集中，IRG评分与NK细胞、IL和T辅助细胞显著负相关，而与Treg和MDSC显著正相关(图7d-h)。
八、GSVA和ssGSEA在IRG亚群之间的免疫和分子功能
1、利用ssGSEA研究脓毒症中的免疫相关通路。结果表明，在GSE65682数据集中，所有显著差异的免疫相关基因集均在IRG低风险组中富集 (图8a)。
2、在GSE63042数据集中，IRG低风险组的基因集在CCR、HLA、MHCI等信号通路中(图8B)。
3、在E-MTAB-4421数据集中，ssGSEA结果显示，IRG低风险组涉及CCR、溶细胞活性等(图8c)。同样，在E-MTAB-4451数据集中，ssGSEA结果显示，CCR、细胞溶解活性、HLA、促炎症活性主要在IRG低危组中富集(图8d)。简而言之，与IRG低危组相比，IRG高危组具有免疫抑制的特征。
九、IRG分类器与关键分子通路的相关性
在多个转录组集合中进行Spearman相关性分析，进一步检测IRG分类器是否与脓毒症中的免疫抑制生物标志物(HLA)相关。结果表明IRG评分与多个数据集的HLA均呈显著负相关(图8E-F)。
十、细胞因子分析
1、应用Wilcoxon试验比较不同IRG类型中细胞因子的表达水平。结果显示， IRG低危组CCL5、IL1B、IL15、TNF的表达水平显著上调，而IRG低危组IL10的表达水平显著下调(图9a)。在GSE63042组中，IRG低危组中IL1B、IL1RN、PDGFRB、TNF、VEGFA的表达水平升高，而在IRG低危组IL10的表达水平显著降低(图9d)。
2、GSE95233组中IFNG、IL1B、IL15和TNF的表达水平显著上调，而IRG低危组VEGFA的表达水平显著下调，IL10的表达水平呈较低的趋势(图9c)
3、在E-MTAB-4421组中，CCL5、CXCL10、IFNG、IL4、PDGFRB的表达水平显著高于IRG低危组，而在IRG低危组中TNF的表达水平有升高的趋势，而在IRG低危组中IL10、IL1B、IL1RN的表达水平显著低于IRG低危组(图9B)。
4、IRG评分分别与多个数据集组IL10/TNF呈显著正相关(图9E-H)。
总结：在本研究中，作者首先基于RF和LASSO回归，识别了枢纽免疫相关基因(IRGs)，并筛选出基于ADM、CX3CR1、DEFA4、HLA-DPA1、MAPK14、ORM1、RETN和SLPI，构建IRG分类器作为诊断和预后模型，该模型与氢化可的松反应和免疫抑制状态密切相关，可能促进特异性治疗的个体化干预。综上所述，根据免疫细胞浸润、免疫相关通路、细胞因子水平，IRG分类器可以有效地反映免疫麻痹，这可能有助于指导免疫调节剂实现免疫稳态。
