Nature | CRISPR–Cas9错配监测机理
原创 图灵基因 图灵基因 2022-03-24 10:42
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CRISPR–Cas9有局限性。在将基因组编辑用于人类治疗应用方面，最令人担忧的问题之一是脱靶DNA切割。尽管一些Cas9变体已经被开发出来，可以改善错配识别，但它们的靶向DNA切割率降低。
由于对Cas9识别错配的潜在机制知之甚少，一组科学家试图使用动力学引导的冷冻电子显微镜来确定Cas9在错配切割不同阶段的结构。在此过程中，他们为设计下一代高保真Cas9变体提供了一个分子蓝图，这些变体可减少脱靶DNA切割，同时保持对靶向DNA的有效切割。利用这一蓝图，他们设计了一种高保真的变体，可以保留野生型靶向切割率，他们称之为“SuperFi-Cas9”。
这项工作在《Nature》杂志上发表的一篇题为“Structural basis for mismatch surveillance by CRISPR–Cas9”的论文中进行了描述。
德克萨斯大学（UT）奥斯汀分校的分子生物科学教授Kenneth Johnson说：“就CRISPR Cas系统在基因编辑中的更广泛应用而言，这确实可以改变游戏规则。”
SuperFi-Cas9切断脱靶位点的可能性要低4000倍，但速度与自然发生的Cas9一样快。德克萨斯大学奥斯汀分校分子生物科学系助理教授David Taylor博士实验室的博士后研究员Jack Bravo博士说，你可以将实验室生成的不同版本的Cas9视为不同型号的自动驾驶汽车。大多数型号都很安全，但它们的最高时速为10英里。“它们比自然产生的Cas9更安全，但代价很高：它们的运行速度非常缓慢。”Bravo说，“SuperFi-Cas9就像一辆自动驾驶汽车，经过精心设计，非常安全，但它仍然可以全速行驶。”
到目前为止，研究人员已经证明了SuperFi-Cas9在试管中对DNA的应用。他们现在正与其他计划在活细胞中测试SuperFi-Cas9基因编辑的研究人员合作。他们还致力于开发更安全、更活跃的Cas9版本。
Taylor和Johnson开发了一种称为动力学引导结构测定的技术，该技术使用Sauer结构生物学实验室的低温电子显微镜对Cas9与错配DNA相互作用时的活动进行成像。
他们惊讶地发现，当Cas9在第18位到第20位遇到这种类型的错配时，它并没有放弃继续前进，而是有一个手指状的结构突入并抓住DNA，使其表现得好像它是正确的序列。通常情况下，错配会让DNA有点松散。这种手指状的结构使它稳定。
“这就像如果你有一把椅子，其中一条腿被折断了，你只是用胶带把它重新粘在一起。”Bravo说，“它仍然可以用作椅子，但可能有点摇晃。这是一个非常糟糕的修复。”
如果没有增加DNA的稳定性，Cas9就不会采取切割DNA和进行编辑所需的其他步骤。以前从来没有人观察过这个多余的手指做这种固定。
Taylor说：“在一百万年的时间里，我永远无法想象会发生这样的事情。”
基于这一认识，他们重新设计了Cas9上的额外手指，这样手指就不会稳定含有错配的DNA部分，而是被推离DNA，从而阻止Cas9继续切割和编辑DNA的过程。结果产生了SuperFi-Cas9，一种与天然Cas9一样容易切割正确靶点的蛋白质，但切割错误靶点的可能性要小得多。
