FastQC使用与结果解读
1.1 FastQC 使用参数指令：fastqc -f inputfile -o outputfile-o 结果文件输出路径，需要自己事先建立好文件夹，默认输出文件是压缩文件，加--noextract则不压缩 -t 设置所使用的核数 -f 强制指定输入文件格式，默认自动检测 -c 污染物选项，输入的是一个文件，格式是Name[Tab] Sequence，#开头的行是注释，里面是可能的污染序列，如果有这个选项，FastQC会在计算时候评估污染的情况，并在统计的时候进行分析 -q 会进入沉默模式，指定这个选项的时候，程序不会实时报告运行的状况1.2 FastQC结果详细解读根据输入指令，能够输出结果有一个.html问价和一个压缩文件，.html文件用浏览器打开即可得到FastQC Report

1.2.1 Summary：整体查阅信息

绿色：PASS；符合质量要求
黄色：WARN；需要查看结果信息
红色：FALL；不符合质量要求1.2.2 Basic Statistics：基本信息统计

Filename：检测的fastq文件名称；File type：文件类型；Encoding：测序平台的版本和相应的编码版本号；Total Sequence：总reads数；Sequences flagged as poor quality：低质量序列数量；Sequence：测得的序列长度范围；%GC：GC含量。Per base sequence quality：序列测序质量统计1.2.3 Per base sequence quality：序列测序质量统计

横轴为read长度，纵轴为质量得分，Q = -10*log(error P)，Q20表示1%的错误率，Q30表示0.1%的错误率；柱状表示该位置所有序列的测序质量的统计，柱状是25%-75%区间质量分布，error bar 是10%-90%区间质量分布，蓝线表示平均数；一般要求所有位置的10%分位数大于20，即最多允许该位置10%的序列低于Q20。当任何碱基质量低于10，或者任何中位数低于25报告WARN，当任何碱基质量低于5或任何中位数低于20报告FALL。1.2.4 Per tile sequence quality 每个tail测序的情况

上图展示了每个tail的测序情况。每个tile的测序质量，横坐标表示序列的长度位置从1到N，纵坐标是tile的编号，蓝色表示测序质量很好，颜色越红越不好横轴表示每个碱基的位置；纵轴是tail的Index编号；这个图主要是为了防止，在测序过程中，某些tail受到不可控因素的影响而出现测序质量偏低；蓝色代表测序质量很高，暖色代表测序质量不高，如果某些tail出现暖色，可以在后续分析中把该tail测序的结果全部都去除。1.2.5 Per sequence quality scores：序列的测序质量

对每条序列（reads）的测序质量统计。假如我测的1条序列长度为101bp，那么这101个位置每个位置Q值的平均值就是这条reads的质量值；该图横轴是0-40，表示Q值，即该序列（reads）质量得分；纵轴是每个值对应的reads数目；我们的数据中，测序结果主要集中在高分中，证明测序质量良好1.2.6 Per base sequence content 序列各个位置碱基比例分布

上图显示了A T C G在每个位置的平均分布情况。横轴表示每个碱基的位置，纵轴表示百分比；图中四条线代表A T C G在每个位置平均含量；理论上来说，A和T应该相等，G和C应该相等，但是一般测序的时候，刚开始测序仪状态不稳定，很可能出现上图的情况。像这种情况，即使测序的得分很高，也需要cut开始部分的序列信息。1.2.7 Per sequence GC content 序列平均GC分布（普遍会出现警告）

上图展示了序列平均GC分布。横轴为平均GC含量； 纵轴为每个GC含量对应的序列数量；蓝线为系统计算得到的理论分布；红线为测量值，二者越接近越好；这里不相符可能有两个原因：GC可以作为物种特异性根据，这里出现了其他的峰有可能混入了其他物种的DNA；目前二代测序基本都会有序列偏向性(所说的 bias)，也就是某些特定区域会被反复测序，以至于高于正常水平，变相说明测序过程不够随机。这种现象会对以后的变异检测以及CNV分析造成影响。1.2.8 Per base N content N碱基含量分布 （基本不出现错误）

上图N碱基含量分布N碱基是指仪器不能识别的碱基，一般不会出现。但是如果出现并且量还很大，应该就是测序系统或者试剂的问题；任意位置的N的比例超过5%，报"WARN"；任意位置的N的比例超过20%，报"FAIL"。1.2.9 Sequence Length Distribution 序列测序长度统计

上图展示了检验文件中序列的长度统计。每次测序仪测出来的长度在理论上应该是完全相等的，但是总会有一些偏差；比如此图中，126-127bp是主要的，但是还是有少量的120-121bp的长度，不过数量比较少，不影响后续分析；当测序的长度不同时，如果很严重，则表明测序仪在此次测序过程中产生的数据不可信。1.2.10 Sequence Duplication Levels 统计序列完全一样的reads的频率

谈到NGS数据的duplicated reads（暂且翻译为“重复数据”），我们通常会直观地认为：duplicated reads是在NGS文库构建过程中，由于PCR过度扩增导致同一个模板DNA片段被反复测序多次，得到一模一样的reads；上图中横坐标是duplication的次数；纵坐标是duplicated reads的数目（红线）；正常情况下的确，测序深度越高，越容易产生一定程度的duplication。高程度的duplication level，提示我们可能有bias的存在（如建库过程中的PCR duplication）。1.2.11 Overrepresented sequences 大量重复序列

Overrepresented sequences是指一条序列的重复数，因为一个转录组中有非常多的转录本，一条序列再怎么多也不太会占整个转录组的一小部分（比如1%），如果出现这种情况，不是这种转录本巨量表达，就是样品被污染。这个模块列出来大于全部转录组1%的reads序列，但是因为用的是前200,000条，所以其实参考意义不大，完全可以忽略。和duplication计算一样，取前200,000进行统计，大于75bp只取50bp；发现超过总reads数0.1%的reads时报”WARN“，当发现超过总reads数1%的reads时报”FAIL“；1.2.12 Adapter Content 序列Adapter

此图衡量的是序列中两端adapter的情况如果在当时fastqc分析的时候-a选项没有内容，则默认使用图例中的四种通用adapter序列进行统计本例中adapter都已经去除，如果有adapter序列没有去除干净的情况，在后续分析的时候需要先使用cutadapt软件进行去接头。接下来就是基于QC结果对数据进行质量控制，我们应用cutadapt来做。