PCR引物设计
⑴ 确定PCR产物片段大小（product length）；
⑵ 确定引物所在区段；
⑶ 确定引物序列的长度范围（primer length ）；
⑷ 确定引物Tm值（melting temperature）范围，Tm=4（G+C）+2（A+T）。
一、PCR引物设计原则
- 引物长度以15-30bp为合适的，最常用的是18-24bp；
- 引物里面的GC含量在40-60%之间是最好的；
- 引物里面的ATCG分布应遵守随机性，避免连续出现4个以上的单一的碱基，尤其在引物的3端不应该出现连续的G/C；
- 引物要求自身不能含有互补序列，否则这个引物自身会形成发夹一样的二级结构，影响PCR作用效果；
- 两个引物之间不应该有多于4个的互补/同源的碱基，否则会形成引物二聚体；
- 引物的3' 端是G/C。
二、Primer Premier 5.0软件设计引物
Primer Premier是由Premier公司开发的、专业用于PCR引物及杂交探针和评估的系列软件，基本上目前引物设计都是基于Primer系列，如ncbi在线引物设计是基于Primer 3。
三、引物设计步骤
①输入序列：安装好软件后，首先打开软件，左上角来操作，file-new-dna sequence，这一项可以把复制的序列粘贴进去，也可以选择另一个file-open-dna sequence去open一个新的文件。②点击Primer进入引物设计界面。③点击引物设计界面上的search按钮进行搜索选项设定。④点击搜索选项界面上的OK按钮可得到引物设计结果。⑤选择分值高的引物对作为实验合成引物选项。⑥根据需要对引物进行编辑。
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