TGF-β超家族包括TGFβ、Activin、Nodal、BMPs等，通过受体丝氨酸/苏氨酸激酶传递信号，对细胞生长、分化、组织再生和癌变至关重要。Smad2和Smad3（Smad2/3）在TGFβ激活后被磷酸化，形成三聚体，可以与共同介质Smad4结合或不结合。Smad4与Smad2和Smad3（Smad2/3）结合形成转录调控复合体在典型的TGFβ信号通路中至关重要，但并非所有响应都必需，不依赖Smad4为共同介质的Smad2/3作用仍研究不足。因此研究Smad2/3在独立于Smad4情况下如何调控mESCs谱系起始和分化，并探索这一过程中的分子机制尤为重要。

近日，上海交通大学基础医学院王琼研究员、Yanhua Du和生命科学技术学院章永春团队合作，共同探讨了TGFβ-Smad信号通路和DNA甲基化在调控小鼠胚胎干细胞（mESCs）从原始态多能性(naïve pluripotency)向始发态多能性(primed pluripotency)转变以及随后的分化过程中的作用。相关研究成果以“A stepwise mode of TGFβ-SMAD signaling and DNA methylation regulates naïve-to-primed pluripotency and differentiation”为题发表在Nature子刊《Nature Communications》上。

标题：A stepwise mode of TGFβ-SMAD signaling and DNA methylation regulates naïve-to-primed pluripotency and differentiation（TGFβ-SMAD信号通路和DNA甲基化模式调控原始态到始发态多能性转换和分化）

期刊：Nature Communications

影响因子：IF 14.7

应用技术：RNA-seq、ChIP-seq、CUT&Tag、ATAC-seq（易基因金牌技术）

本研究引入了一个逐步模式，其中Smad2/3通过与不同效应因子合作来调控小鼠胚胎干细胞（mESCs）的谱系启动和分化。在从原始态多能性向始发态多能性转变的过程中，Smad2/3上调DNA甲基转移酶3b（Dnmt3b），建立了适当的DNA甲基化模式，进而使Smad2/3能够结合到外胚层标记基因的启动子和增强子的低甲基化区域。因此，在Smad2/3缺失情况下，Smad4单独不能启动外胚层特异性基因转录。当始发态外胚层细胞开始分化时，Dnmt3b在全基因组甲基化中的活跃度降低，Smad4与Smad2/3形成复合物以支持中胚层和内胚层诱导。因此，缺乏Smad4的mESCs可以经历启动过程，但在下游分化中遇到困难。本研究揭示了TGFβ信号及其在细胞过程中作用的复杂机制。

研究方法

使用CRISPR/Cas9编辑技术生成Smad2/3和Smad4敲除（KO）小鼠胚胎干细胞系。

通过RNA测序（RNA-seq）分析野生型（WT）、Smad2/3敲除（S2/3DKO）和Smad4敲除（S4KO）细胞的差异表达基因（DEGs），以及主成分分析（PCA）、基因本体（GO）分析、基因集变异分析（GSVA）。

利用染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）和CUT&Tag技术研究Smad2/3和Dnmt3b的基因组结合位点。

ATAC-seq分析开放染色质区域，以了解染色质可及性。

WGBS和MeDIP分析ES和EpiLC阶段WT和Dnmt3b敲除（3bKO）细胞的DNA甲基化水平。

免疫共沉淀（IP）和质谱（MS）用于鉴定与Smad2/3互作的蛋白质，包括Dnmt3b。

Western blot检测特定蛋白质的表达水平；免疫荧光检测特定蛋白质在细胞内的表达和定位。

体外蛋白质-蛋白质互作实验：使用GST融合蛋白和His标签融合蛋白进行体外拉下实验，以研究蛋白质间的直接相互作用。

结果图形

（1）S2/3DKO 和 S4KO的的差异转录组分析

图1：mESC分化过程中Smad2/3和Smad4的差异需求。 A. 对野生型（WT）、Smad2/3双敲除（S2/3DKO）和Smad4敲除（S4KO）细胞系中Smad2/3和Smad4蛋白的Western blot分析。Tubulin为对照。 B. 对WT、S2/3DKO和S4KO在mESC（第0天，D0）和胚胎体（EB）分化4天（D4）产生的RNA-seq数据进行主成分分析（PCA）。 C. WT、S2/3DKO或S4KO的D4 EBs的RNA-seq数据MA图。与WT相比，在S2/3DKO或S4KO中上调（红色）或下调（蓝色）基因。每个条件分析两个生物学重复样本。 D. 分别以红色和蓝色条表示上调和下调的差异表达基因（DEGs）。 E.  在D0或D4 EBs中WT、S2/3DKO或S4KO的所有DEGs热图。 F. 左侧点线图显示（E）中C2和C4的平均表达模式。右侧显示C2和C4中基因的GO分析。 G. 使用GSVA分析从D0到D4在WT、S2/3DKO和S4KO中的RNA-seq数据的谱系基因表达模式。ICM，内细胞团；PrE，原始内胚层；PreEpi，前外胚层；PostEpi，后外胚层；PS，原条；End，内胚层；Mes，中胚层；Ect，外胚层；VE，内脏内胚层。 H. 热图显示WT、S2/3DKO和S4KO的mESC（D0）和D4 EBs中与外胚层相关的基因。 I. 热图显示WT、S2/3DKO和S4KO的mESC（D0）和D4 EBs中的PS或中胚层基因。 J. WT、S2/3DKO和S4KO的mESC（D0）、EB D3和D4中的谱系标记基因表达qRT-PCR分析。

（2）在Smad4缺失情况下，外胚层（Epiblast）可以形成

图2：Smad4缺失情况下的外胚层形成。 A. 图表展示从mESC向EpiLC转变过程（顶部）。mESCs在从2i+LIF培养基转移到含有Activin A和bFGF的N2B27培养基中培养6天后，转变为EpiLCs。实验5次重复，展示WT、S4KO、S2/3DKO以及用Smad2/3拯救的S2/3DKO在转变过程中细胞形态变化的代表性图像（底部）。 B. 通过qRT-PCR分析诱导EpiLCs期间多能性基因（Nanog, Oct4）和着床后外胚层基因（Fgf5, Dnmt3a/3b, T）的mRNA水平。 C. 维恩图显示WT中Smad4 ChIP-seq、WT中Smad2/3 ChIP-seq和S4KO中Smad2/3 ChIP-seq之间的重叠峰值。注释了与7926个峰值相邻的基因，其中标记了始发态外胚层基因。 D. 热图显示在AC处理的S4KO D3 EBs中，Smad2/3和Smad4的ChIP-seq标签密度在11080个高置信度Smad2/3结合位点±1.5 kb基因组区域内。SB，SB431542，TGFβR的选择性抑制剂；AC，Activin A，Nodal/Activin受体的可用配体。 E. Fgf5、Dnmt3a、Dnmt3b和T位点的基因轨迹视图。在SB或AC处理的D3 EBs和未处理的D0 mESCs中进行Smad2/3和Smad4 ChIP-seq。底部示意性表示RefSeq基因结构。

（3）Dnmt3b与Smad2/3互作

图3：Dnmt3b与Smad2/3互作。 A. Smad2/3共免疫沉淀和质谱（IP-MS）分析维恩图。在WT和S4KO的D3 EBs中进行Smad2/3 IP-MS，包括未处理的、用SB或AC处理的样本。在所有三个比较中（S4KO与WT、S4KO+AC与S4KO+SB、S4KO与S4KO+SB）鉴定出16种蛋白质，包括Dnmt3b。 B. 经SB或AC添加处理后，通过使用Dnmt3b、pSmad2/3、Smad2/3和Smad4抗体的western blot实验分析WT和S4KO D3 EBs中Smad2/3的免疫沉淀。 C. 在Smad2/3/4TKO细胞中，HA标记的Smad2/3（HA-S2/3）或/和Smad4（HA-S4）被过表达，进行靶向HA的免疫沉淀western blot分析。细胞在SB或AC处理后收集。 D. 在AC处理的WT和S4KO D3 EBs中，分析Smad2/3的染色质结合蛋白的免疫沉淀，使用了Dnmt3b、Smad2/3、Smad4和Otx2抗体的western blot分析。 E. 展示WT、S4KO和S2/3DKO D3 EBs的PLA实验的代表性共聚焦图像。 F. 在293T细胞中过表达HA标记的Smad2（HA-S2）或Smad3（HA-S3），或/和Flag标记的Dnmt3b（Flag-3b）。在进行抗Flag免疫沉淀后检测Flag和HA的western blot。 G. 使用细菌表达的GST-Dnmt3b或GST-GFP，以及6x组氨酸标记的Smad2（His-S2，左）或Smad3（His-S3，右）进行GST拉下实验。 H. 使用细菌表达的GST-Dnmt3b或GST，以及6x组氨酸标记的Smad2（His-S2，左）或Smad3（His-S3，右）进行His拉下实验。

（4）Smad2/3上调Dnmt3b对外胚层形成至关重要

图4：Smad2/3上调Dnmt3b对外胚层形成非常重要。 A. 对WT、S4KO、S2/3DKO和S2/3/4TKO细胞在EB分化（D0、D3和D4）期间的Dnmt3a、Dnmt3b、Eomes、Smad2/3和Smad4蛋白水平进行western blot分析。 B. mESC-EpiLC-ME两步诱导方案（顶部）。将细胞转移到含有Activin A和bFGF的N2B27培养基中培养6天后，EpiLCs进一步在加入CHIR99021的N2B27培养基中培养24小时以形成ME。western blot显示WT、S4KO和S2/3DKO中Dnmt3a、Dnmt3b、Eomes、Smad4和Smad2/3的表达。 C. 对WT、S2/3DKO、S4KO以及带有Dnmt3b shRNA 1或2的S4KO细胞的EB分化（D0、D3）和EpiLC诱导（D0、D4、D6）期间的始发态外胚层基因（Dnmt3b、Fgf5）和多能性基因Oct4进行qRT-PCR分析。 D. WT、S4KO和S2/3DKO EBs中5-mC（红色）和DAPI（蓝色）染色的代表性共聚焦显微镜图像。 E. IGV视图显示WT和Dnmt3b敲除（3bKO）中Sox2位点在ES和EpiLC阶段的WGBS信号谱。CpG岛（紫色）和差异甲基化区域（DMRs）（红色）也进行标记。在WT、S2/3DKO和S4KO的D3 EBs中进行Sox2 DMR1和DMR3的DNA甲基化水平的MeDIP-qPCR分析。 F. qRT-PCR检测WT、S2/3DKO和S4KO细胞在EB分化前后（D0、D3、D4）的Sox2 mRNA水平。

（5）Dnmt3b独立于Smad4介导Smad2/3与外胚层基因结合。

图5：Dnmt3b独立于Smad4介导Smad2/3与外胚层基因结合。 A. Fgf5基因位点的WGBS、ChIP-seq和CUT&Tag分析综合视图。WGBS以及H3K27ac、H3K4me1和H3K4me3的ChIP-seq在ESC或EpiLC阶段进行，H3K36me3 ChIP-seq在小鼠E6.5外胚层进行。Smad2/3 ChIP-seq在WT和S4KO的EBs中进行（本研究），Dnmt3b CUT&Tag在WT、S4KO、WT+Dnmt3b-shRNA2（WT+3b-sh2）和S4KO+Dnmt3b-shRNA2（S4KO+3b-sh2）的EBs中进行，Flag CUT&Tag实验在Dnmt3a-Flag或Dnmt3b-Flag细胞中进行；WT和S4KO EBs中Dnmt3a或Dnmt3b的ChIP-seq显示在底部。 B 在Dnmt3b-Flag EBs中68204个Dnmt3b结合位点±1.5 kb基因组区域内Flag CUT&Tag的标签密度热图，以及在WT或S4KO中32717或11080个Smad2/3结合位点中心的Smad2/3 ChIP-seq。 C. S4KO和S4KO+3b-sh2的EBs中Smad2/3 CUT&Tag的基因轨迹视图，靶向Fgf5、Dnmt3a和Dnmt3b位点。 D. 在S4KO和S4KO+3bsh2周围7926个Smad4独立的Smad2/3峰值的Smad2/3 CUT&Tag信号热图。 E. Dnmt3b依赖的Smad2/3结合位点峰值得分图。标记了与峰值相邻的外胚层标记基因。 F. 对WT、S2/3KO、S4KO+Scr-shRNA、S4KO+3b-Sh1或S4KO+3b-sh2细胞系的D3 EBs中Fgf5启动子（Fgf5_PP）、基因体（Fgf5_GB）和增强子（Fgf5_+30k、Fgf5_+40k和Fgf5_+56k）的Smad2/3和Dnmt3b结合进行ChIP-qPCR分析。使用抗IgG的ChIP作为阴性对照。

易小结

本研究通过RNA-seq、ChIP-seq、CUT&Tag、ATAC-seq、WGBS等分析揭示了Smad2/3在mESCs向EpiLCs转变过程中通过诱导Dnmt3b表达来调控DNA甲基化模式，从而促进原始态多能性向始发态多能性的转变。同时还揭示了在Smad2/3缺失情况下，Smad4单独不能启动Epiblast特异性基因转录。在分化过程中，Dnmt3b活性降低，Smad4与Smad2/3形成复合物，支持中胚层和内胚层的诱导。

总之，本研究阐明了TGFβ信号通路在细胞过程中的复杂机制，特别是Smad2/3和Smad4在mESCs的原始态多能性向始发态多能性转变以及随后分化中的作用，提出了一个逐步调控模型。

参考文献：

Zhao B, Yu X, Shi J, Ma S, Li S, Shi H, Xia S, Ye Y, Zhang Y, Du Y, Wang Q. A stepwise mode of TGFβ-SMAD signaling and DNA methylation regulates naïve-to-primedpluripotency and differentiation. Nat Commun. 2024 Nov 22;15(1):10123. pii:10.1038/s41467-024-54433-5. doi: 10.1038/s41467-024-54433-5. PubMed PMID:39578449.