Ka，Ks（或Dn，Ds），这两个值以及他们的比值分别被赋予了一定的生物学意义。其中最为常用的是两者的比值，存在这么一种常见认知：
- ka/ks>>1 正选择
- ka/ks~1 无选择（中性进化）
- ka/ks<<1 负选择（或纯化选择）
注意到>>和<<，这两个符号事实上是在暗示显著大于或者显著小于，毕竟差异是绝对存在的，但差异是不一定显著的。
同样被经常提及的指标择是，非同义突变率Ks。存在这么一种认知，前提假设：选择压力往往会作用于蛋白水平，可以认为：如果核酸水平发生了突变，同时没有改变氨基酸序列，那么不受选择压的影响。(当然，这是多数情况。目前关于非编码序列的研究，不影响这个认知的主要假设）。既然不受选择压，那么所有突变可以在一定的时间尺度（以mya为单位计算）很好地被保留。通过公认的突变时间（比如有化石支撑的演化时间）校准出相应的核酸突变速率（突变数目/时间长度），那么就可以通过对当前序列之间的突变数目，反推序列之间的分歧时间，进而作为物种分化时间的佐证。（当然，我们也知道，分子进化时间和物种分化时间不完全一致）。
很好，费了一大段话说明ka和ks，那么就进入主题。
一个合理的问题解决方式
近日在忙课题的事情，也基本没有再写工具了。一方面是时间，一方面是需求。早上6点多忽然醒来，看了下手机。。。*有人要踢馆....*
我当然不会拒绝，
只要问题被合理地提出，而不是一上来就说你的软件有bug，多数情况下，软件开发者是会有较好的反应，除非他真的很忙。
事实上，我基本的认知就是序列比对出现问题。当然，这个问题，或者出现在用户上，或者出现在TBtools上，毕竟我是从通过先翻译成蛋白，比对完了再转换会codon。我最担心的，其实还是自己写的kaks计算逻辑，虽然NG法简单，但是不代表我一定能写对。
于是我要来序列，随后就是直接把序列集合丢给TBtools，输出一个结果，
确实是NaN，那么这个时候，应该重现一下用户的软件结果，（原本是计算用章张老师的Ka_ks_calculator的，然而...用起来有点麻烦），于是我还是还是用了Dnasp...（发现需要先做序列比对！！！），我导入不进去....当然，此时要来用户的比对结果
一看比对结果，我就淡定了，必然是用户提供了不适合的比对结果给Dnasp，而导致后者出错。因为Dnasp，并没有限制你就不能输入非codon alignment的结果。
于是，我打开mega，直接拿用户提供的原始CDS序列，做了codon alignment，随后导入Dnasp，Done。
结果完全一样(因为DNAsp，只有NG法）
到底是为什么？
随着高通量测序的普及，我们可以非常方便地拿到大量基因序列。于是会有更多人开始去使用一些软件，试图得到一些结果，并用于探索相应的生物学问题。使用工具，是人与动物的差别，善于使用工具，或许是人与人之间的差别。无论如何，正确的使用软件，或许是拿到正确结果的基本要求。（比如，存在部分人一直用blast，却根本不知道blast的局限和所长，参数也不会调；当然，这不是问题，因为blast的默认参数已经可以适用于大多数比对场景）。
KaKs的计算逻辑，其实很容易找到。最经典的莫过于NG法。具体可参考
但是无论使用什么算法，codon alignment是一定要的。因为codon对是基本计算单元。
上述用户提供的alignments，很明显，只是核酸水平的比对结果，不能用于计算kaks，即使出结果，那么也是不正确的。
所以，正确的使用工具很重要。
如何使用TBtools的Ka/Ks批量计算工具
第一步，打开TBtools
随后设置输入文件
- CDS序列集合，可以是整个物种的CDS而无需整理，TBtools会依据给定的基因对，提取对应的序列进行使用
- 基因对，制表符分隔
- 可选的输入是，蛋白序列文件（如果没有设置，TBtools会自动翻译输入的CDS序列为蛋白，使用的是标准密码子，用于指导Codon alignment；如果设置了，那么会直接使用），我没有设置过
设置输出文件，注意必须设置文件路径而不仅仅是某个目录
点击Start即可，TBtools会对基因对进行逐对处理，首先是蛋白比对，随后是转换成codon alignment，最后是计算，并输出结果。
Done! 祝我生日快乐！今天早上好像一下子好几个大流找我....
写在最后
OK，一个小时就这么过去了。推文写完了，早餐也吃完了。干课题了。如果你想要这两个序列，那么你需要加入到TBtools使用交流QQ群 831029231。
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园艺植物小分子RNA与基因组研究-夏瑞课题组
