过去十年，靶向DNA序列变异的治疗方法取得了显著进展，癌症医学也因此受益匪浅。然而，纯粹基于基因的治疗选择方法存在局限性，因为同一基因型可以衍生出多种不同的细胞状态。在多细胞生物中，细胞状态异质性是由表观遗传过程驱动的，这些过程调控着转录等基于DNA的功能；而这些过程的紊乱是癌症的标志性特征，并导致缺陷细胞状态的出现。单细胞技术的进步使我们能够量化肿瘤的表观基因组异质性并理解其机制，从而彻底改变了我们对表观基因组变化如何驱动癌症演化的认识。本综述探讨了表观基因组异质性和可塑性作为细胞状态库，进而成为肿瘤演化来源的观点。文中讨论了量化表观基因组异质性的最佳实践，并探讨了其各种成因和后果，包括表观基因组重编程、随机变化和持久记忆。本文还探讨了限制表观基因组异质性的新治疗方法的设计，其长期目标是限制癌症的发生和发展。（Published online: 16 October 2024）
癌症发展轨迹涵盖了一个连续谱，从癌前细胞及其周围基质启动肿瘤发生开始，最终演变为具有潜在侵袭性、转移性和/或耐药性的表型。数十年的基因组学研究揭示了遗传变异（单核苷酸多态性或体细胞突变）在肿瘤演变中的关键作用。然而，与正常的发育过程类似，越来越多的证据表明，非遗传变异在驱动癌症相关表型变化方面也发挥着至关重要的作用，这种作用独立于遗传改变，无论是在癌症发生初期还是在肿瘤演变过程中。这些非遗传变异中包括染色质变异，指的是基因组中区分癌细胞状态的位点，其特征在于由于表观基因组标记的丢失或获得而导致的染色质状态改变。这些表观基因组标记包括DNA甲基化、组蛋白翻译后修饰、组蛋白变体和核小体定位（图1）。
表观基因组标记的精确调控对于基因表达的调控和细胞身份的维持都至关重要。因此，这些标记的破坏是癌症的普遍特征。事实上，非遗传变异可以启动肿瘤的形成。例如，在小鼠中，通过表观遗传沉默CDKN2A并激活PDGFRA，可以诱发异柠檬酸脱氢酶(IDH) 突变型胶质瘤。PDGFRA基因的激活是通过破坏CTCF的绝缘体功能介导的，而CTCF绝缘体功能的破坏是通过其结合位点的甲基化实现的。类似地，染色质因子（表观基因组标记的读取器、写入器或擦除器）的扰动可以促进肿瘤的形成；例如，DNA甲基转移酶1 (DNMT1) 功能低下的小鼠存在整体DNA低甲基化，并最终发展为侵袭性淋巴瘤。在果蝇中，即使是polyhomeotic（一种多梳蛋白）的短暂丢失也足以转化细胞，这凸显了染色质变体在癌症发生中的重要性。此外，在TET2功能缺失突变的淋巴瘤中，恢复完整的染色质因子可以阻断癌症进展，这表明TET2失活在癌症发生中起着因果作用。除了这些功能性证据外，在大多数癌症中，正是由于缺乏已知的遗传驱动因素，才使得人们开始关注非遗传变异在肿瘤发生中的潜在作用。例如，后颅窝A型儿童室管膜瘤缺乏复发性遗传变异，但表现出DNA高甲基化，并且对基于DNMT抑制剂的表观遗传疗法特别敏感，这表明表观基因组机制是其发生的唯一原因。
同样，仅凭基因突变无法完全解释原发性疾病向转移性疾病的进展。在高级别浆液性卵巢癌中，对多个转移灶的分析表明，转移性疾病是多克隆的，并且一部分亚克隆没有特有的基因突变。在胰腺导管腺癌中，尽管对超过26个不同的转移灶进行了测序，但尚未发现转移灶特异性的驱动突变。相反，另一项研究发现了转移灶特异性的染色质变异，其特征是组蛋白H3第9位赖氨酸的二甲基化或三甲基化（H3K9me2或H3K9me3）的缺失，而原发肿瘤则没有这些变异。来自对功能性染色质变异的直接观察以及来自基因驱动突变缺失的间接证据的累积表明，非遗传变异是癌症发生和发展不可或缺的组成部分。与基因变异不同，染色质变异在一定程度上是不稳定的，这为通过靶向驱动癌细胞状态的非基因变异来预防或治疗癌症提供了独特的干预机会。因此，开发描述表观基因组变异的方法学和概念工具对于理解这种变异的产生方式及其如何驱动肿瘤进化过程至关重要。
在本综述中，我们使用“表观基因组异质性”一词来描述癌前组织或肿瘤中表型不同的细胞状态共存的现象，每种状态都具有一组独特的染色质变异。我们探讨了表观基因组异质性和可塑性反映了细胞状态库的扩大，这些细胞状态可以通过表观基因组重编程、随机变异的选择或持久记忆来驱动肿瘤的演化。我们讨论了肿瘤演化过程中表观基因组变异的动态变化及其在肿瘤表型演化中的作用。我们还探讨了如何通过更深入地理解肿瘤获得和利用表观基因组异质性的方式（无论是通过染色质变异的稳定传递还是随机过程），来指导设计针对表观遗传过程的有效预防或治疗方法。
癌症中的单细胞表观基因组学
本综述是对先前关于单细胞表观基因组技术的深入综述的补充，描述了已用于研究患者或癌症模型中肿瘤演化表观基因组基础的技术（补充表1）。许多此类单细胞技术最初是为研究正常组织的发育和异质性而设计的；迄今为止，只有转座酶可及染色质测序的单细胞分析（scATAC‑seq）被广泛应用于癌症研究（表1）。单细胞表观基因组技术在癌症研究中应用有限，部分原因是采样方面的挑战（框2）。然而，一些技术进步已经开始揭示癌症中的表观基因组异质性。
框 2 | 采样挑战
单细胞表观基因组技术在癌症研究中的应用有限，部分原因是采样方面的挑战，包括需要包含大量细胞的生物样本，以及与单细胞或单核分辨率兼容的保存方法。大多数单细胞表观基因组技术需要包含数十万个细胞的新鲜或冷冻样本，而可用于研究的生物样本库中的肿瘤样本通常是福尔马林固定、石蜡包埋的标本，仅包含几千个细胞。尽管单细胞方法已成功应用于冷冻组织，但这些方法通常仅限于一两种表观基因组测量模式。要以单细胞分辨率全面表征肿瘤表观基因组，需要一系列表观基因组检测方法，包括组蛋白修饰、DNA甲基化、染色质构象或核小体位置。就此而言，癌症的单细胞表观基因组学仍处于起步阶段（见下图）。这些技术的开发与其首次应用于癌细胞之间存在着明显的间隔。
理解表观基因组异质性在肿瘤演化中的作用，得益于时间序列（time-series）测量，可以比较疾病进展的各个阶段，或研究对抗癌治疗的反应。然而，由于从临床环境中获取纵向样本极其困难，因此，采用这种方法完成的研究寥寥无几。对疾病各阶段表观基因组异质性的研究比较了同一患者体内共存的不同疾病阶段的样本，例如原发肿瘤和远处转移灶，或与同步癌前病变共存的肿瘤。此外，世界各地已出现快速尸检项目，用于从近期去世的个体体内多个转移部位采集肿瘤样本，有时还会采集匹配的生物样本库原发肿瘤样本。
为了最大限度地减少侵入性连续肿瘤取样的使用，表观基因组学检测方法已进行改进，以使用可非侵入性采集的样本，例如血液或尿液。出于伦理和操作方面的考虑，在癌症模型中也更容易获得时间序列样本。癌细胞系在表观基因组学研究中发挥了重要作用（表1）。基于患者来源的类器官、患者来源的异种移植模型和基因工程小鼠模型的先进癌症模型可以模拟肿瘤发生不同阶段的肿瘤及其微环境的复杂性。对单一模型中收集的纵向样本进行研究，也有助于控制与遗传多态性相关的表观基因组变异。
癌细胞状态的决定因素
表观基因组特征在定义癌细胞的各种状态中起着至关重要的作用。单细胞表观基因组技术的重大进展（框1）使得对癌症各个阶段的表观基因组异质性进行详细探索成为可能。
癌前状态的表观基因组特征。结直肠癌中遗传变异的顺序获得是癌前细胞向癌细胞状态转变的一个典型模型。通过整合来自息肉、肿瘤和邻近正常结肠黏膜同步样本的单细胞RNA测序（scRNA-seq）和单核ATAC测序（snATAC-seq）数据，我们得以重建结肠癌形成早期阶段的完整图谱，涵盖了已分化细胞和干细胞样细胞状态。本研究展示了如何利用染色质变异追踪癌症起始过程中的细胞群体动态，通过对结直肠癌患者结肠内共存的不同阶段的癌前细胞和癌细胞进行采样，鉴定了与癌症进展相关的染色质变异和异常基因表达模式。该方法揭示了染色质变异与癌前阶段细胞群体向干细胞样状态的转变相关(Becker W. R.et al.,Nat. Genet, 2022)。类似地，对巴雷特食管患者的单细胞ATAC测序（scATAC-seq）研究表明，肠化生区域由混合的癌前细胞状态组成，并且癌前细胞在通常仅限于胃或肠组织的增强子处表现出染色质可及性（图2a）。在小鼠胰腺癌发展过程中，一项针对正常、炎症、癌前和肿瘤组织的单细胞表观基因组学研究发现了染色质变异，这些变异能够启动癌前上皮，并最初导致多种Kras突变细胞状态的出现，特别是通过扩展细胞间通讯网络。
肿瘤内表观基因组多样性。许多研究致力于描述已建立肿瘤的表观基因组异质性。例如，在胶质瘤中，scATAC-seq通过识别与每种细胞状态相关的候选转录因子，在理解同一肿瘤内共存的各种癌细胞状态的调控基础方面发挥了重要作用。这些不同的表观遗传定义的细胞状态表现出独特的功能特性，并对肿瘤演化产生不同的影响。例如，FOXD1驱动的侵袭性胶质母细胞瘤干细胞状态的存在是与生存率低相关的不良预后因素。在妇科癌症中，scATAC-seq揭示了以染色质变异为特征的癌细胞状态，这些变异定义了不同的调控元件，从而影响参与标志性癌症通路基因的表达。一项针对11种不同癌症类型的225多个肿瘤样本的单细胞ATAC测序研究，鉴定出了泛癌和癌症类型特异性的调控单元以及相关的转录因子，这些调控单元和转录因子是肿瘤发生的驱动因素。在另一项研究中，飞行时间流式细胞术（cytometry by time-of-flight, CyTOF）分析在儿童胶质瘤中发现了一种独特的表观基因组异质性，其中两种共存的肿瘤细胞表观基因组亚群可以通过组蛋白H3第27位赖氨酸三甲基化（H3K27me3）或乙酰化（H3K27ac）水平的差异来区分。
单细胞DNA甲基化数据使得在循环肿瘤细胞（circulating tumour cell, CTC）群体中识别罕见的个体癌细胞状态成为可能。类似地，对肺腺癌的单细胞DNA甲基化谱分析揭示了表皮生长因子受体（EGFR）突变癌细胞中一组独特的染色质变异，并将这种基因变异与患者来源癌症样本中表观基因组异质性的出现联系起来。将来自同一细胞或细胞群的单细胞DNA甲基化数据与转录组和基因组数据整合，已被用于测量胶质瘤中的表观基因组随机性（图2b）。DNA甲基化的随机变化也可能使细胞能够应对压力条件，包括接受抗癌治疗。此外，胶质母细胞瘤细胞中CTCF结合位点DNA甲基化的随机变化可能作为转录变异的基础，并可能促进克隆选择。
癌症治疗反应。治疗反应和耐药性与表观基因组异质性相关，包括染色质可及性、组蛋白修饰和DNA修饰的变异。例如，对基底细胞癌连续活检样本进行snATAC-seq分析，已鉴定出免疫治疗后T细胞耗竭的潜在表观基因组驱动因素。类似地，在多发性骨髓瘤中，一项纵向snATAC-seq和RNA-seq研究表明，针对G蛋白偶联受体C家族5成员D（GPRC5D）的治疗耐药性可能归因于使GPRC5D基因座失活的获得性染色质变异。对配对的治疗前和治疗后胶质母细胞瘤样本进行snATAC-seq分析发现，治疗后样本中由AP-1转录因子驱动的间充质细胞状态富集。
此外，对匹配的未经治疗和复发性胶质母细胞瘤之间H3K27me3图谱的演变进行分析，能够识别出反映肿瘤内表观基因组异质性的癌细胞状态连续谱。利用单细胞染色质免疫沉淀测序（scChIP-seq）分析管腔型乳腺癌和三阴性乳腺癌的患者来源异种移植模型中H3K27me3的表达，揭示了这些肿瘤中启动子区域这种抑制性组蛋白修饰富集的异质性。特别是，未经治疗的肿瘤中预先存在的细胞群与治疗耐药细胞具有相似的表观基因组特征（局部H3K27me3富集缺失）（图2c）。这些细胞在接受癌症治疗后可能会产生耐药细胞群，尽管还需要进一步的治疗诱导染色质改变才能达到完全耐药。对三阴性乳腺癌体外模型进行额外的单细胞H3K27me3谱分析，进一步绘制了癌细胞在多个时间点接受治疗后的表观基因组演变图谱，并揭示了耐药持续细胞（drug-tolerant persister cells, DTP细胞，即癌症治疗的最初幸存者）所共有的特定抑制性表观基因组。
监测表观基因组肿瘤演化
了解表观基因组异质性在肿瘤演化中的作用，得益于时间序列或多位点单细胞表观基因组测量（图3a），这使得我们能够比较疾病的连续阶段并识别对抗癌治疗的反应。然而，在临床环境中获取同一患者的多个样本面临着巨大的挑战（框2），目前只有少数研究采用了这种方法。本节将描述多重采样的挑战，并探讨如何利用单个表观基因组快照来重建表观基因组演化过程。
表观克隆动态的推断。除了样本可用性之外，纵向和多区域采样研究的整合也带来了计算方面的挑战。越来越多的分析方法正在被设计出来以应对这些挑战。除下文提到的少数例外情况外，大多数用于从单细胞数据推断细胞轨迹的计算方法主要是为scRNA-seq开发的，需要进行调整以应对单细胞表观基因组技术带来的独特挑战。单细胞表观基因组测量本质上是稀疏的，每个细胞的中位读取数比scRNA-seq低50-100倍。这种情况的出现是因为基因组位点的总潜在信号从根本上受到DNA分子拷贝数的限制，这导致二倍体基因组中每个DNA元件的读取数为零、一或二。此外，还必须确定用于单细胞表观基因组分析中特征计数的相关信息离散化单元。例如，研究人员可以使用功能分割方法（例如基于基因的启动子或增强子注释），或者采用更通用的方法（例如滑动窗口或固定大小的区间）。
一种计算方法是将纵向研究视为时间序列，其中“实时”信息用于指导模型并预测细胞状态转变。例如，Waddington最优传输模型利用这种方法从基因工程小鼠肺癌纵向样本中分离出一簇具有高度可塑性的过渡细胞。分析预测这些细胞将产生多种其他癌细胞状态，从而导致肿瘤内异质性。另一种方法是通过将观察到的但未经监督的变异（例如表观基因组和转录组状态的变化，或给定状态细胞比例的变化）与肿瘤演化阶段相关联，从而在没有预先了解时间线的情况下重建细胞状态转变。来自纵向和多区域样本的单细胞表观基因组数据的积累也可以受益于人工智能方法的进步。这些方法已经能够从单细胞转录组学数据中区分细胞状态并构建基因调控网络模型，现在也开始预测基因扰动的影响。基于人工智能的方法还可以通过识别单细胞表观基因组数据中的复杂模式来促进肿瘤演化的建模。
基于单细胞数据预测细胞分化潜能。在缺乏从多个时间或空间样本中收集的数据的情况下，可以使用替代计算方法，根据单细胞表观基因组数据预测细胞分化潜能（图3b，前瞻性重建）。例如，可以基于染色质状态方差和细胞内熵来量化细胞内表观基因组变异或“噪声”，从而评估细胞向特定分化路径的定向性（图3c）。当应用于白血病细胞样本中获得的DNA甲基化数据时，该方法揭示了相邻CpG位点甲基化水平的随机不一致性，研究人员将其称为局部无序甲基化区域，这一特征与不良临床结果相关。由于染色质状态的相互依赖性，这种方法可以应用于其他单细胞表观基因组学检测数据类型，例如检测相邻核小体上大规模组蛋白修饰的一致性，并有助于区分低效和高效癌细胞群。
与提供每个细胞评分的细胞内表观基因组噪声测量方法互补的是，测量细胞间变异性旨在捕捉细胞群体内的表观基因组异质性（图3d）。为此，可以使用多种指标，包括成对细胞间相关性和香农熵。例如，一项针对去势抵抗性前列腺癌的scRNA-seq研究比较了几种正交方法来量化从管腔表型向基底表型转变的细胞簇中的细胞间变异性。该分析揭示了在此转变过程中细胞间变异性的瞬时增加。研究人员使用创新的单细胞测量方法（例如细胞类型概率熵）以及细胞类型基因特征评分来量化非遗传治疗耐药性出现过程中谱系保真度的丧失增加。然而，将这些指标应用于单细胞表观基因组学数据仍有待检验，并且需要进行功能性实验来验证预测的效力评分。
基于多模态信息的细胞潜能模型。多组学技术的进步为通过评估染色质变异和细胞状态，在单一数据集中测量细胞潜能提供了新的契机。例如，匹配的scRNA-seq和scATAC-seq研究已被用于量化特定表观基因组产生多种转录输出的能力，这可作为早期胰腺肿瘤发生过程中细胞潜能的指标（图3e）。创新的实验方法现在能够以单细胞分辨率进行多种表观基因组测量，从而从单个表观基因组快照预测肿瘤的演变（图3e）。例如，一种能够对异染色质（通过标记富含H3K9me3的区域）和常染色质（通过标记可及染色质区域，如scATAC-seq）进行单细胞分析的双重检测方法已被提出，用于测量染色质速度，而染色质速度是细胞潜能的一个相关指标。这种方法源于这样的逻辑：相反的表观基因组修饰的比例（量化表观基因组的一致性和不一致性）可以作为细胞增殖能力的指标（类似于利用外显子和内含子序列的比例，通过单细胞RNA测序数据预测细胞未来状态）。这种双重检测方法能够预测肿瘤演化的轨迹，例如，在耐药性发展过程中，染色质变异体的动态获取情况。多标记单细胞染色质检测技术以及捕获多种DNA甲基化形式的其他方法的进步，为开发结合多种表观基因组修饰的指标来预测细胞增殖能力提供了更多机会。
谱系追踪结合单细胞表观基因组学。将单细胞表观基因组学检测与系统发育重建相结合，是另一种从单个表观基因组快照模拟肿瘤演化的有效方法（图3b，回顾性重建）。系统发育重建可以通过追踪内在遗传变化或利用外源谱系报告基因来实现。将表观基因组学分析与内在谱系重建相结合的初步研究已展示了该方法的技术可行性。例如，从DNA甲基化变化推断出的谱系树与白血病中通过遗传谱系追踪获得的谱系树相吻合。另一种方法是将scATAC-seq数据与线粒体DNA突变检测相结合，以识别与特定染色质变异相关的肿瘤亚克隆，这表明在白血病患者体内存在易于产生耐药性的细胞。将通过分子条形码进行外源谱系评估并整合到单细胞表观基因组学分析中，为研究肿瘤演化过程中的表观基因组变异提供了一种很有前景的技术，尽管目前应用此方法的研究还很有限。例如，在三阴性乳腺癌中，前瞻性慢病毒条形码方法结合snATAC-seq和RNA-seq技术，揭示了与肿瘤起始和化疗耐受性相关的转录程序和染色质变异模块。我们预期，未来几年将有大量研究整合从多种表观基因组学分析中获得的关于时间表观基因组变异的数据，以了解肿瘤演化的基础。一个值得关注的可能发展方向是将空间组学技术与谱系条形码技术相结合，这可以补充空间表观基因组学（例如空间CUT&Tag）的进展。
单细胞表观基因组学面临的挑战
当前局限性。目前的单细胞表观基因组学方法存在两个主要局限性。首先，覆盖范围有限，因为染色质变异通常在核小体水平上进行测量，而核小体水平仅跨越数百个碱基对（相比之下，在单细胞转录组学中，每个基因的累积信号可以跨越数千个碱基对的串联序列）。其次，单个细胞中的信号放大效果不佳，因为在二倍体基因组中，信号只能从一到两个等位基因中检测到；而在单细胞转录组学中，可以通过扩增单个细胞的全长RNA来增强转录本的检测，从而实现每个细胞近乎完整的转录组测序。
为了绕过单细胞表观基因组数据固有的扩增和覆盖率问题，目前已采用三种方法。第一种方法称为伪混合（pseudo-bulking），即将多个相似的单细胞谱图聚合起来，从而能够从原本稀疏的数据集中推断染色质变异的获取情况。第二种方法是将千碱基（kilobases）染色质结构域的信号串联起来，这涉及合并来自功能相关DNA序列（例如大型异染色质结构域）的信号，以提高每个细胞的覆盖率。最后，对纯化细胞群进行批量分析（bulk profiling）有助于确定稀有细胞亚型的特征，这些特征可用于挖掘单细胞表观基因组数据，并揭示伪混合策略可能遗漏的功能性细胞群。深入了解表观基因组异质性需要对患者样本进行大规模表征，并分析大量的单细胞。最终，技术创新对于实现每个细胞近乎完整的表观基因组测序至关重要，它能够提高每个细胞中多种表观基因组修饰（无论是单独还是组合）的信息读取数。
新兴的单细胞表观基因组学方法。一系列新兴的空间和多模态单细胞表观基因组学方法，为我们理解表观基因组异质性带来了新的维度，并即将被应用于癌症研究。空间scATAC-seq已应用于乳腺癌研究，其基于条形码的固相捕获。类似地，总组蛋白修饰的空间定量分析揭示了乳腺肿瘤中组蛋白修饰富集的模式。能够直接在组织中实现染色质可及性或组蛋白修饰空间分辨率的原位标记方法，正为探索癌症中的空间表观基因组异质性铺平道路。尽管已在癌细胞系中开展了单细胞染色质构象分析（scHi-C）的概念验证研究，但由于数据集覆盖率低，目前该技术在患者来源的肿瘤样本中的应用仍受到限制。
多模态表观基因组学方法，即在同一细胞中同时测量多种表观基因组模式，有望通过组合信息（表观基因组编码的固有属性）加深我们对癌症表观基因组失调的理解。例如，单细胞核小体占用率和甲基化组测序（scNOMe-seq）以及基于转座酶的单细胞基因组和表观基因组测序（scGET-seq）已被应用于癌细胞系，以同时探测DNA甲基化和染色质可及性，或常染色质和异染色质。此类多模态表观基因组学单细胞技术的整合，以及用于研究代谢物或蛋白质水平的互补单细胞技术的开发，有望增进我们对癌症表观基因组学的理解。
表观基因组异质性的起源
多种机制可导致细胞中染色质变异的出现。某些变异会导致细胞缺陷状态（Defective cell states），而一部分表观基因组异质性在生理条件下可被细胞容忍。
遗传和表观遗传变异
遗传学和表观遗传学在癌症进化中存在着明显的联系，因为编码染色质因子和组蛋白变体的基因是所有癌症类型中最常见的突变基因之一。例如，组蛋白变体H3.3的错义突变导致赖氨酸27被甲硫氨酸取代，这种突变在许多儿童脑癌中均有发现，并已被确定为改变癌细胞表观遗传状态的机制之一。肿瘤内所有细胞共有的染色质因子突变可能在癌症发展早期就已获得，例如胶质母细胞瘤中的IDH1突变或透明细胞肾细胞癌中的PBRM1（编码SWI/SNF染色质重塑复合物成员）突变。相反，染色质因子基因（例如SETD2，编码组蛋白赖氨酸N-甲基转移酶SETD2）的突变可能在肿瘤演化的后期阶段出现，此时这些突变更可能特异性地存在于特定亚克隆中。大约10-20%的透明细胞肾细胞癌存在SETD2突变。TRACERx（Tracking Cancer Evolution Through Therapy，通过治疗追踪癌症演化）研究组的研究也报道了类似的染色质因子基因亚克隆突变。
编码染色质因子或组氨酸变体的基因突变可导致染色质变体的积累，并显著增加癌细胞的表观基因组异质性。例如，在白血病中，染色体易位导致KMT2A赖氨酸甲基转移酶与其他染色质调控蛋白融合，从而在基因启动子处产生异常的二价染色质状态，这些启动子同时被H3K4me3和H3K27me3标记，而非仅被其中一种标记。这些二价位点在同一患者的细胞中表现出高度的表观基因组变异性。与之相反，染色质因子的突变也可能降低表观基因组异质性。例如，EZH2的激活突变会导致先前处于二价状态的启动子彻底沉默，从而阻断正常的B细胞分化。
在非小细胞肺癌和黑色素瘤模型中进行的基因敲除筛选表明，癌细胞对环境压力的适应可以通过染色质因子的失活来介导，特别是那些由泛癌突变研究中被归类为癌症驱动基因的基因编码的因子。例如，多梳抑制复合物2（PRC2）蛋白或染色质重塑因子SMARCD1的失活会增加癌细胞对营养匮乏的耐受性，这表明表观基因组调控的破坏会阻碍癌细胞对压力的促凋亡和抗增殖反应。
此外，在肿瘤演化过程中，基因变异和染色质变异的获得之间存在明显的相互影响。染色质可及性的改变会影响结直肠癌中DNA突变的积累。反过来，全基因组加倍会触发染色质的构象变化，从而导致致癌染色质变异的形成。基因变异和染色质变异也可以在肿瘤演化的统一过程中趋同，发挥相似的致癌功能。这些发现表明，基因变异和染色质变异同步出现以支持肿瘤演化，这强调了理解它们之间功能关系的重要性。
代谢和环境波动
肿瘤的发生发展与多种环境信号密切相关，包括癌细胞为促进自身生长而对能量、生物质（biomass）生产和氧化损伤解毒的需求增加所导致的代谢波动。这些代谢波动会生成染色质变异体并增加表观基因组异质性，因为许多细胞代谢物是染色质因子的辅助因子或底物。例如，通用甲基供体S-腺苷甲硫氨酸水平的降低会干扰组蛋白和DNA的甲基化，从而影响癌细胞的甲基化。
缺氧条件也能诱导染色质变异：例如，表观遗传修饰酶Fe(II)/2-氧戊二酸加氧酶需要克雷布斯循环中间体2-氧戊二酸（由IDH1-IDH3产生）以及氧气和Fe(II)来催化氧化表观基因组修饰，例如羟基化和去甲基化。在缺氧条件下，诸如ten-eleven translocation (TET) 和含Jumonji C结构域的组蛋白赖氨酸去甲基化酶 (KDM) 等酶家族受到抑制。缺氧通过抑制赖氨酸特异性去甲基化酶KDM5A和KDM6A来诱导组蛋白赖氨酸高甲基化。此外，缺氧通过限制TET酶活性来阻止DNA去甲基化，这模拟了IDH突变癌症中染色质变异的获得。缺氧也被认为有利于驱动儿童后颅窝A型室管膜瘤的染色质变异的形成。
此外，癌症进展过程中获得的染色质变异体依赖于代谢适应。例如，胰腺癌转移灶由于染色质修饰的大规模重编程，与原发肿瘤相比，表现出更高的葡萄糖依赖性。除了代谢波动外，环境暴露于香烟烟雾也会诱导染色质变异体的形成，从而促进肿瘤发展：组蛋白抑制性修饰的初始丢失之后，会出现异常的DNA甲基化模式。类似地，炎症也与DNA甲基化模式的改变有关，这已在结肠炎诱导结肠癌的小鼠模型中得到证实。在这些小鼠中，炎症相关的DNA高甲基化导致对胃肠道稳态和损伤反应至关重要的基因沉默。总而言之，环境波动和代谢变化会导致细胞中染色质变异体的积累，从而促进肿瘤的进化过程。
随机表观基因组变异
随机表观基因组变异（Stochastic epigenomic variation）是指细胞表观基因组随时间推移发生的随机生物学变化的积累，这些变化可能被细胞耐受，也可能导致细胞功能改变。随机表观基因组变异还可以促进表观克隆（epi-clones）的形成。与由突变或环境因素驱动的定向表观基因组变化不同，随机表观基因组变异是细胞内在过程自发产生的。
然而，随机表观基因组变异背后的机制尚不完全清楚。尽管DNA复制是一个受到严格调控的过程，但如果复制偶联的组蛋白沉积或新复制的DNA链中DNA甲基化标记的复制过程中出现缺陷，则DNA复制仍存在获得随机染色质变异的风险。复制时间的差异会加剧这些风险，并且在不对称细胞分裂和对称细胞分裂中可能受到不同的影响。此外，当染色体分离错误或在微核形成和破裂的不同阶段，也会出现随机表观基因组变异，这两种情况都为染色质变异的产生创造了条件，而这些变异会对基因表达产生长期影响。复制非依赖性染色质组装的不准确性，例如转录过程中发生的不准确性，也是获得随机表观基因组变异的潜在途径。DNA修复过程与随机表观基因组变异密切相关，因为它涉及损伤修复前后的染色质重塑。例如，人为诱导DNA双链断裂被认为会引发“表观遗传漂移(epigenetic drift)”，其特征是染色质变异体随年龄增长而积累。尽管关于随机表观基因组变异的起源仍有很多未知之处，但癌症的发生和发展越来越多地与那些既非由基因突变也非由环境信号引起的染色质变异体联系起来。
表观基因组对肿瘤演化的控制
受其他研究者的启发，表观基因组异质性对肿瘤细胞进化潜能的贡献可以可视化为能量图，该图强调了表观基因组机制在控制细胞状态能量平衡和转变潜能方面的作用（图4）。理解每个能量谷（由其深度、宽度和与其他能量谷的高度差定义）对细胞状态转变的具体限制，对于设计有效的抗癌疗法至关重要，这些疗法旨在解决影响肿瘤进化的动态表观遗传过程。例如，如果肿瘤进化依赖于一群已启动的癌细胞的扩增，那么针对该特定细胞群的靶向疗法可以根除癌症。然而，由于癌细胞的内在补充能力，同样的疗法对于阻止部分癌细胞的适应性变化则无效。
表观基因组随机性增加
表观基因组异质性会扩大癌细胞的吸引盆地（basin of attraction，所有细胞都可以达到的初始细胞状态集合）（图4a），从而导致出现许多具有亚稳态基因表达程序的变异细胞状态。连续的吸引盆地代表不同的亚稳态细胞群库，这些细胞群可能包括具有肿瘤起始能力的细胞（肿瘤前细胞）或已准备好耐受药物治疗的细胞（耐药前细胞）。在肿瘤前肺癌细胞、肿瘤起始期的结直肠癌细胞以及治疗耐受性发展过程中，均观察到肿瘤和癌前细胞样本中非遗传细胞间变异性的增加。在这些异质性细胞状态中，一些可能具有适应性优势，并在特定应激因素（例如炎症或药物治疗）下被选择。在白血病模型中，转录组异质性的增加一直是适应性最强克隆的特征。基因表达的变异性也可以作为肿瘤演化的驱动因素。例如，在尤文氏肉瘤中，致癌性EWS-ETS融合转录因子（如EWSR1-FLI1）活性水平的波动导致癌细胞在增殖和迁移状态之间振荡。这种振荡在转移性肿瘤细胞扩散和转移灶生长之间的转变中起着至关重要的作用。
将正常细胞转化为癌细胞，或将原发性癌细胞转化为复发性癌细胞所需的染色质变异体的性质和数量，取决于细胞的起源类型以及细胞状态之间的能量限制。细胞状态之间能量水平（ΔG）的微小差异即可导致自发转变，这表明细胞具有更高的可塑性（pliancy, 细胞在不改变自身状态和相关功能的情况下，容忍基因和/或染色质变异的能力）。虽然该术语最初是用来描述细胞对遗传变异体的耐受能力，但我们认为它可以扩展到涵盖细胞对染色质变异体以及突变体的耐受能力。
表观基因组重编程
与表观基因组随机性相反，表观基因组重编程描述了细胞对环境信号的主动响应，即染色质变异的获得，从而导致新的细胞状态（图4a）。一个显著的例子是雄激素依赖性前列腺腺癌向雄激素非依赖性神经内分泌前列腺癌（NEPC）的转分化。这种表型转变通常与对雄激素剥夺疗法的耐药性发展相关。向NEPC的转分化与染色质变异的积累有关，这是由于DNA甲基化和染色质可及性的改变所致。染色质因子，例如EZH2和特定的转录因子，在这一转变过程中起着关键作用。谱系追踪研究证实，转分化是前列腺癌治疗耐药性的一种非遗传机制，由表观基因组重编程介导。
在管腔型乳腺癌（luminal breast cancers）中，内分泌治疗耐药性可能由表观基因组重编程驱动，这涉及组蛋白修饰的复杂且全局性的变化，从而触发细胞状态的转变。具体而言，DTP细胞表现出异染色质标记H4K20me3、H3K9me2和H3K27me3的富集；抑制生成这三种标记的甲基转移酶可减少DTP细胞的出现。相反，在三阴性乳腺癌中，化疗耐药性依赖于染色质变体的获得，而这种变体的获得是由H3K27me3和DNA甲基化的重编程介导的。抑制EZH2足以将化疗敏感的癌细胞转化为DTP状态，但也可以阻止已建立化疗耐药状态的癌细胞的增殖。
肿瘤微环境的变化或抗癌治疗引起的应激可通过激活转录因子启动表观基因组重编程，特别是先锋因子（pioneer factors, 具有独特能力的转录因子，能够启动封闭染色质的打开。），能够识别致密染色质内的靶DNA序列，从而触发局部染色质重塑，这不仅发生在发育过程中，也发生在癌症中。例如，在结肠癌小鼠模型中，先锋因子SOX9对于癌症的发生至关重要，而SOX9介导的肿瘤发生涉及发育基因的局部染色质重塑。二价修饰的基因启动子也能促进转录因子介导的表观基因组标记的重新分布。例如，在乳腺癌细胞中，二价ZEB1启动子控制着参与上皮-间质转化的转录因子的表达。这种转变积极促进了转移起始细胞状态的形成，使乳腺癌细胞能够更容易地对环境信号做出反应。
表观基因组记忆
暴露于压力和外部刺激可启动持久的表观基因组重编程，即使在恢复稳态后也能维持，从而在细胞上留下表观基因组“记忆”，影响其对未来压力的反应。小鼠肿瘤起始模型中炎症反应最能体现这一现象，其中表观基因组记忆被认为可以降低特定细胞状态转变的能量屏障（图4a）。例如，对胰腺癌小鼠模型和类器官模型的scATAC-seq研究表明，暴露于炎症应激的KRAS突变细胞会积累染色质变体，表明其从腺泡细胞状态向肿瘤细胞状态转变。这种在转化前对染色质状态的“启动（priming）”与之前的研究结果一致，这些研究表明，胰腺肿瘤发生早期炎症诱导的表观基因组记忆的特征是化生相关基因上H3K4me1的增加。在肺癌小鼠模型转移进展的研究中也报道了类似的表观基因组启动（epigenomic priming）现象。同样，伤口愈合会导致印记表观基因组记忆，其特征是组蛋白2A第119位赖氨酸的泛素化（H2AK119ub）减少，这种染色质变体与肿瘤发生增强有关。在接受癌症治疗的患者中，目前尚不清楚第一轮癌症治疗是否能在残留癌细胞中诱导表观基因组记忆，从而影响后续治疗的反应。
选择动态性
尽管表观基因组重编程是公认的癌症标志之一，但该领域的一个核心问题在于，选择压力是否倾向于那些已经具备高潜能的癌细胞亚群，使其能够进入各种细胞状态，还是这种压力驱动着一种适应性过程，促使癌细胞向不同的细胞状态演化。随着单细胞表观基因组检测、谱系追踪工具和计算方法的最新进展，我们现在有望揭示驱动肿瘤演化的表观基因组变异相关的选择动态。
关于肿瘤起始的单细胞研究很少（图4b）。在肺癌小鼠模型中，癌前细胞中观察到细胞状态不稳定性（即吸引盆地扩大）的瞬时增加。这一发现可被解释为癌症中表观基因组不稳定性（epigenomic instability, 细胞无法长期维持表观基因组标记的完整性。）促进了罕见表观克隆的后续扩增。在其他癌症模型中也观察到了肿瘤发生初期细胞间表观基因组不稳定性类似的增加。在黑色素瘤中，已鉴定出一个空间局部化的微环境，癌前上皮细胞在该微环境中通过与内皮细胞的相互作用获得肿瘤起始潜能，这表明在适当的微环境信号下，许多细胞都具有肿瘤起始的潜能。
单细胞条形码研究和基于克隆的实验为癌症获得治疗后耐药性的过程提供了重要的见解（图4c）。未经治疗的癌细胞能够随机地在DTP前状态之间循环。在治疗选择压力下，这些DTP前细胞可以通过活跃的表观基因组介导的过程转变为静止的DTP状态。这种静止的DTP状态是可逆的，癌细胞在停止治疗后可以重新获得对药物的敏感性。然而，从非循环DTP到循环DTP的转变——这种转变与非遗传驱动的癌症进展相关，即使接受了治疗——仅由一部分DTP细胞实现。这些细胞表现出独特的转录程序，将其代谢重定向到脂肪酸氧化。代谢通路在多种模型中均与基因表达程序的启动密切相关：例如，在接受化疗的乳腺癌中，一些参与代谢的基因被鉴定为瞬时DTP前细胞状态特征的一部分，而蛋氨酸失衡则维持了耐药细胞状态。进一步的研究表明，多种非遗传性的耐药细胞状态可以从同一癌细胞群中产生，每种状态都由DTP前状态的分子差异决定，并由治疗策略（所用药物和剂量）进行独特选择。
要全面了解肿瘤的演变，需要对细胞后代及其表观基因组特征进行体内监测和空间定位。这些方法对于确定细胞状态如何演变至关重要，并有助于研究人员设计针对肿瘤演变过程中动态表观基因组过程的有效抗癌疗法。
靶向表观基因组异质性
与DNA序列突变不同，染色质变异可以通过化学试剂进行靶向治疗。这一特性引发了人们对开发靶向表观基因组过程的潜在疗法的浓厚兴趣。
临床试验的启示
目前，仅有九种表观遗传药物获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准，可作为单药疗法用于癌症治疗（表2）。这些药物大多获准用于血液肿瘤，仅有两种获准用于实体瘤。除这两种药物外，迄今为止研究的大多数表观遗传疗法作为单药疗法治疗实体恶性肿瘤均无效；接受治疗的患者在I期临床试验中未表现出客观的治疗反应，且毒性反应严重。这种有限的成功可能归因于表观遗传疗法缺乏特异性以及药物在实体瘤中的生物利用度低。正在进行的临床试验正在测试表观遗传疗法与其他药物的联合应用，旨在提高患者对标准治疗或新型疗法（例如免疫检查点抑制剂）的反应。在此，我们将这些试验的设计与我们已建立的概念框架联系起来进行探讨，该框架旨在描述表观基因组异质性如何指导肿瘤演变。
目前正在进行的将表观遗传疗法与传统抗癌药物相结合的临床试验遵循三种主要策略。第一种策略旨在克服与已知染色质变异相关的、对现有表观遗传药物敏感的、对标准治疗产生耐药性的肿瘤。这种方法在特定癌症类型中显示出前景，例如铂类耐药卵巢癌（II期临床试验，NCT00477386）和激素耐药雌激素受体阳性转移性乳腺癌（III期临床试验，NCT02482753）。在这些试验中，当检测到治疗期间癌症进展的迹象时，会将基于抑制特定DNMT和组蛋白去乙酰化酶的表观遗传疗法添加到标准治疗方案中。因此，该方法旨在通过强制细胞状态转换来靶向表观基因组变异引导的肿瘤演变，从而使肿瘤细胞重新获得对标准疗法的敏感性。
第二种方法是在给予标准抗癌药物之前，通过表观遗传药物预处理来启动癌细胞，旨在最大限度地提高抗癌治疗的疗效。迄今为止，采用这种设计的研究很少。例如，一项正在进行的III期临床试验（II/III期NCT02159820）正在评估在开始标准铂类和紫杉醇治疗之前，使用低剂量DNMT抑制剂对初治卵巢癌患者进行预处理的效果。该策略旨在通过在开始标准一线治疗之前选择性地靶向DTP前细胞状态，来降低肿瘤的表观基因组异质性，从而防止与癌症复发相关的表观基因组重编程。从临床角度来看，与联合治疗试验相比，这种研究设计还具有最大限度降低毒性的优势，因为联合治疗试验中观察到了严重的毒性。
第三种策略在2020年近一半的已报道试验中被采用，这些试验将表观遗传药物与抗癌疗法联合使用，旨在利用表观遗传疗法最大化免疫疗法的效果。这些疗法的联合应用有可能通过解除内源性逆转录病毒和其他重复序列的抑制，将免疫抑制性（“冷”）肿瘤转化为免疫开放性（“热”）肿瘤。解除抑制会导致双链RNA的产生，从而触发癌细胞的抗病毒先天免疫反应，并使癌细胞能够被免疫细胞识别，这一过程被称为病毒模拟（详见其他文献的综述）。在这种试验设计中，表观遗传疗法会增加肿瘤的初始表观基因组变异，而宿主免疫细胞则充当肿瘤演化的调控者。此外，表观遗传疗法还可以驱动免疫细胞分化为更具反应性的表型，从而克服对免疫检查点疗法的耐药性。单细胞表观基因组学方法对于优化这些免疫再激活机制的时机和效率至关重要，例如，通过确定所有肿瘤细胞是否反应一致，或者识别哪些肿瘤细胞群是免疫系统的靶点。
未来展望
目前的研究方向和临床前研究主要集中在三个相互关联的策略上，以限制肿瘤的发生和/或进展：靶向表观遗传驱动的细胞状态脆弱性；逆转获得的染色质变异或阻止由表观基因组重编程引导的细胞状态转变；以及限制肿瘤细胞群体变异的程度，从而限制表观基因组异质性（图5）。
第一种策略是靶向干细胞样细胞或DTP细胞在治疗过程中激活的促生存通路（图5a）。例如，多种癌症模型中的DTP细胞依赖于代谢酶，例如磷脂氢过氧化物谷胱甘肽过氧化物酶（GPX4），以防止通过铁死亡而死亡。抑制这些酶可以选择性地杀死DTP细胞，并增强抗癌疗法的疗效。在包括HER2阳性乳腺癌和肺癌在内的多种癌症中，DTP细胞也发现了类似的脆弱性。在白血病中，对溴结构域和末端外基序（BET）蛋白（BRD2-BRD4和BRDT）抑制剂治疗的非遗传耐药性与特定通路相关，例如WNT-β-catenin通路，该通路可以作为靶点来克服治疗耐药性。该策略利用的是新出现的DTP或治疗耐药细胞状态的非遗传脆弱性，而不是直接针对表观基因组脆弱性。
第二种策略侧重于识别使细胞群能够跨越能量屏障的必要机制（图5b）。靶向参与这些转变的表观基因组过程，可以通过使癌细胞恢复到未经治疗（DTP前）状态来恢复其对癌症治疗的敏感性，或者通过阻止癌细胞向DTP状态的转变来提高抗癌疗法的疗效。特定的组蛋白去甲基化酶，例如肺癌和黑色素瘤中的KDM5A，或胶质母细胞瘤和三阴性乳腺癌中的KDM6A和KDM6B，均与多种癌症类型的这些转变有关，抑制这些酶可以部分阻止治疗过程中DTP细胞的出现。同样，靶向驱动细胞状态转变的转录因子（例如黑色素瘤中的视黄酸受体RXRγ）或增强子转换（例如急性髓系白血病）可以预防癌症复发。强制逆转与治疗耐药性相关的细胞状态转变可以恢复治疗敏感性。例如，对雄激素拮抗疗法耐药的前列腺癌可以通过EZH2抑制剂或Janus激酶抑制剂或成纤维细胞生长因子受体（FGFR）抑制剂治疗而重新获得治疗敏感性。此外，阻断向易转移细胞状态的转变，例如肺腺癌中RUNX转录因子激活所诱导的转变，可能有助于限制癌细胞扩散。一些有前景的研究还表明，通过靶向肿瘤形成之前发生的细胞状态转变的非遗传机制，可以延缓肿瘤发生。
第三种策略旨在最大限度地减少癌细胞群体的变异性，从而减少异常细胞群体的出现，这些异常细胞群体更容易在治疗或应激反应中转变为问题表型（图5c）。例如，乳腺癌中表观基因组酶（如KDM5B）的过表达与转录组异质性的增强有关，而转录组异质性又与内分泌治疗耐药风险的增加相关。降低这种异质性可以降低产生耐药癌细胞群体的概率。
展望未来，至关重要的是要加深我们对遗传和非遗传肿瘤演化过程各自贡献的理解。此类研究对于制定及时合理的策略至关重要，以便在相关细胞类型中于适当的时间点拦截非遗传肿瘤演化。
结论
单细胞表观基因组学技术正在彻底改变我们对表观遗传过程在肿瘤演化中作用的理解，并使我们能够模拟这些过程对肿瘤演化过程中细胞状态转换的影响。随着这些技术的成熟和数据质量的提高，越来越多的癌症患者单细胞表观基因组学研究有望在为靶向表观基因组异质性的新型治疗策略的设计提供强有力的理论依据方面发挥关键作用。单细胞表观基因组学研究前所未有的分辨率与表观遗传疗法设计的复兴不谋而合。新兴的靶向策略，例如蛋白水解靶向嵌合体（PROTACs）和抗体药物偶联物，有望开发出新一代表观遗传疗法，以解决现有小分子药物特异性差的问题。首批靶向含溴结构域蛋白的PROTACs目前正处于I期临床试验阶段（NCT04965753），同时，一些化合物正在研发中，旨在靶向对表观基因组异质性至关重要的表观遗传复合物，例如PRC2或Brahma相关因子（BAF）复合物（SWI/SNF家族成员）。此外，组蛋白去乙酰化酶抑制剂已与癌细胞特异性抗体联合使用，用于靶向HER2扩增的乳腺癌和EGFR阳性癌症，这表明表观遗传疗法具有靶向递送至肿瘤细胞的潜力。这些创新方法，以及对表观基因组异质性在肿瘤演变中作用的深入理解，将有助于在未来几年内通过实现这些疗法的精准给药时间和细胞特异性靶向，降低表观遗传疗法相关的风险。这些改进对于提高这些疗法的疗效、减少其不良反应至关重要，从而改善患者的治疗效果。
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