酵母文库类似于一个储存大量外源基因片段的仓库，利用酵母细胞作为载体，将外源基因片段插入到酵母菌内，形成一个包含大量基因片段的集合。酵母文库可以用于研究基因的功能、表达、互作等各个方面，是生物学研究中的重要工具之一。当把我们研究的目标基因成功构建到载体上，并成功构建酵母文库，可以便捷得用于包括筛库等各项后续实验。

通过酵母文库技术，可以构建全基因组的蛋白质互作网络，分析蛋白质的结构、功能、调控和演化，发现新的蛋白质和信号通路。如酵母双杂是利用酵母文库研究蛋白质互作的经典策略。

利用酵母文库进行蛋白组学、基因组学等研究，不仅更加经济便捷，而且被广泛认可。

酵母文库构建，有两种常用的方法：

SMART扩增技术和Gateway重组技术，具体选择哪种方法进行文库构建，RNA的起始量是选择的一个重要依据。

一、SMART法

SMART技术是由Clontech于1996年开发的，SMART的出现是一个里程碑，SMART是Switching Mechanism At 5’ end of the RNA Transcript的缩写，最初用于构建哺乳动物cDNA文库，后来也用于构建酵母cDNA文库。

1. SMART技术原理

在合成cDNA的反应中事先加入的3’末端带Oligo（dG）的SMART引物，由于逆转录酶以mRNA为模板合成cDNA，在到达mRNA的5’末端时碰到真核mRNA特有的“帽子结构”，即甲基化的G时，会连续在合成的cDNA末端加上几个（dC），SMART引物的Oligo（dG）与合成cDNA末端突出的几个C配对后形成cDNA的延伸模板，逆转录酶会自动转换模板，以SMART引物作为延伸模板继续延伸cDNA单链直到引物的末端，这样得到的所有cDNA单链的一端有含Oligo（dT）的起始引物序列，另一端有已知的SMART引物序列，合成第二链后可以利用通用引物进行扩增。由于有5’帽子结构的mRNA才能利用这个反应得到能扩增的cDNA，因此扩增得到的cDNA就是全长cDNA。

2.SMART法实验流程

二、Gateway法

Gateway技术是由Invitrogen于1999年开发的，最初用于构建无限制性酶切位点的克隆载体，后来也用于构建酵母文库。

1.Gateway技术的原理

利用细菌噬菌体λ的重组系统，将特异性的重组序列加到DNA片段的两端，从而实现不同载体间的DNA转移。Gateway重组技术包括两个步骤：BP反应和LR反应。BP反应是将目的基因片段与载体进行重组，形成Entry克隆。LR反应是将Entry克隆与目的载体进行重组，形成Expression克隆。Gateway重组技术的优点是可以快速、高效、准确地构建文库，而且可以方便地将基因片段转换到不同的载体中。

2.Gateway法实验流程

三、建库材料选择

酵母酵母文库构建的材料可以选择植物组织、动物组织/细胞、菌液或完成提取未降解的RNA。

提取的RNA经琼脂糖凝胶电泳应能清晰看到28S和18S两条带；经分光光度仪检测，OD260/OD280应在1.8-2.2之间，OD260/OD230应大于2。

四、Q&A

1.如何选择酵母文库构建技术？

SMART 文库所需 RNA 总量低，进行均一化处理有效降低基因的冗余，富集低丰度表达基因。一步重组，实验周期更短。

Gateway 酵母文库需要总 RNA 量较高，但是采取分离 mRNA 的方法，不经过 PCR 过程所以不会导致基因过度冗余，但可能会出现低丰度表达基因的丢失。

2.如何进行文库质检？

可以选择常规方法挑取24个单克隆，通过琼脂糖凝胶电泳，确认插入基因的片段大小。

可以选择通过全测序文库，对建成的酵母文库进行全测序，准确了解文库中成功构建了哪些基因，基因序列是怎样的。