Gibson Assembly和Golden Gate Assembly这两种方法都可用于无缝克隆，今天学习golden gateway。
每种基于限制酶的克隆方法都有其优缺点（pluses and minuses），但是Golden Gate 克隆在合成生物学和基因工程领域都很有用，下面介绍如何在克隆时运用这个准确且易于使用的系统。
Golden Gate 克隆技术依赖于1996年首次发现的IIS型限制酶，。IIS型限制酶和传统的限制酶不同，其切割位点和识别位点不同，会在识别序列外切割出4个碱基的粘性末端，因此可以定制切割序列，如果设计成功的话，识别位点不会出现在最后的载体中，可以完成准确的无缝克隆。
克隆计划如下：在目的基因切割位点外设计IIS型限制酶（BsaI或BbsI）识别位点，酶切连接后该识别位点被消除，不会出现在最后的载体中；载体上含有与目的基因的切割位点互补的突出末端，可以指导连接。
如下图所示，含有相同突出末端的目的片段和载体相连接。Entry DNA的突出末端序列可能存在于原始质粒上（Option 1）或者通过PCR扩增添加（Option 2）。
01Golden Gate克隆的优点
1、时间短：Golden Gate克隆就实验时间而言是最简单的克隆方法，因为酶切和连接在一个30min的反应中即可完成。
2、效率高：destination载体和entry载体被添加在一个含有IIS型限制酶和连接酶的管中，虽然原始的destination载体和插入片段还可以自连接，但是由于仍含有IIS型限制酶识别位点，所以还会被酶切；而成功的连接产物不再含有酶切识别位点，所以连接效率接近100%。
3、可连接的片段多：4个碱基的特异性末端能用来连接多个片段——可以在一个反应中连接多达10个片段。不同的突出末端可以确定片段的连接顺序，连接后限制酶识别位点的消失有利于成功连接。虽然随着DNA片段数量的增加或者片段非常小或大，效率会降低，这些问题可以通过筛选更多的单克隆得以解决。
Golden Gate连接相比其它克隆方法有一些优点：
基于核酸外切酶的方法如Gibson连接，DNA片段末端需要20-40bp的同源序列确定连接顺序，所以若目的片段本身的5'或3'末端含有同源序列则不能用此法连接，但可用Golden Gate克隆。
使用Gateway 克隆系统会产生含有一个编码8个氨基酸的attB重组痕迹的结构，但是Golden Gate连接能设计成无痕的，并且比许多商业化的克隆方法都要便宜。
02Golden Gate和合成生物学
合成生物学已经将Golden Gate克隆方法用在了分子克隆策略中，有时称其为MoClo，这个策略利用了IIS型限制酶BsaI和BpiI/BbsI可一次性有效组装多达6个片段的特点。和所有基于Golden Gate的方法一样，该系统也利用了IIS型限制酶切割识别位点外的序列，并且允许含有相同突出末端的DNA片段组装的能力。通过设计独一无二的限制酶切割位点可以帮助DNA片段按顺序连接，这就可以帮助多个DNA组分（启动子、基因、终止子等）在一个反应中准确连接。
03Golden Gate和基因工程
2011年，Bogdanove和Voytas团队描述了一种新的基于Golden Gate的基因编辑技术，该技术可通过多个DNA片段的有序组装来构建TALEN（类转录激活因子核酸酶）。使用这些可利用限制酶BsaI和BsmBI的质粒，可以在几步内快速有效地构建TAL序列。
CRISPR技术也运用了Golden Gate克隆，在含Cas9序列的质粒中插入合适的gRNA低聚核苷酸靶序列，这不仅使连接一个gRNA变得简单，也可连接多达7个gRNA。
04Golden Gate的缺点
Golden Gate并非100%不依赖于序列，为避免预料之外的酶切，IIS型限制酶识别位点不能存在于所连接的片段内部。解决这个问题的方法是改造目的片段，通过PCR扩增在片段内识别位点上创造沉默的点突变，用IIS型限制酶特异性酶切PCR产物并在退火步骤后得以连接。如果目的基因和destination载体内部含有多个限制位点则有可能不能改造，需要考虑使用Gateway克隆或者Gibson连接。
另一个需要注意的是粘性末端的设计，虽然理论上可以有256种不同的切割序列，但是只通过一个不同的碱基区分不同的序列可能会产生错误的产物。
不管用于上述何种应用，Golden Gate克隆无疑是一种能在一个简单且高效的步骤中完成克隆复杂载体的强大工具。
