材料（其他材料见单克隆细胞培养上清的制备)
含有5~10mmol /L HEPES 的DMEM 完全培养基和DMEM- 10 完全培养基，pH 为7.2~7. 4
70% (V/ V) 乙醇
FBS
10% (m/V) 叠氮钠，可选的
850cm2滚筒式培养瓶和滚简装置，37°C
250ml 塑料锥底离心管，无菌
离心机转子
0. 45μm 过滤装置，可选的
流程
增殖杂交瘤（见单克隆细胞培养上清的制备 ，步骤1) ，以1 : 10 的比例分离部分细胞到装有DMEM-10/ 5~ 10mmol/L HEPES 培养基的175 cm2培养瓶中（使培养液总共100ml) 。为了用蛋白A亲和色谱法纯化MAb, 需单独检测有FBS 的培养基以排除污染（可能会与MAb 一起被纯化出的杂蛋白） 。如果需要，则在无血清培养基中培养细胞。
当细胞已达到分离移种标准（一般为1 X106~2 X 106个细胞／ ml) 时，将培养瓶内容物转移到850cm2滚简式培养瓶中。加入150ml DMEM-10 完全／ H EPES 培养基（使培养液总量达到25 0ml ) 。塞紧瓶塞，置于滚筒装置，于恒温室或培养箱37°C 恒溫培养1~2d 。
用浸有70％乙醇的纱布擦拭培养瓶口和瓶颈。打开培养瓶．加入250ml 含有 HEPES 培养基的DMEM-10 完全培养液（使培养液总最达到500ml) 。塞紧瓶塞，置于滚筒装置， 37°C 恒温培养1~2d 。
擦拭瓶口，打开培养瓶，加入2L 含有HEPES 的DMEM- 10 完全培养液（使培养液总量达到2500m l )，基本装满整个培养瓶。为防止起泡，先加入培养基，后加入FBS 至培养液总量的10 % 。塞紧瓶塞，置于滚简装置， 37°C恒温培养至培养基变黄（大约需要5d ；不要过长时间滚动培养瓶，以免细胞发生破碎） 。
将培养液倒入250ml 锥底离心管。室温下， 250g 离心20min。取上清， 弃沉淀。若不进行培养上清的生物学检测，则加入10 ％的叠氮钠溶液至总员的 0.02% 。若需对培养上清进行亲和色谱或盐析纯化，先用0.45 μm 过滤装置过滤培养上清。将培养上清分装后冰冻储存。
