分子杂交（Molecular Hybridization）是分子生物学领域的核心技术之一，其本质是利用核酸分子（DNA/RNA）的碱基互补配对原则，使带有标记物的核酸序列与靶基因的核酸序列在形成双链杂交分子继而进行检测的过程。目前，该技术已成为对特定核酸序列进行检测、分析与定位的重要工具，在生命科学研究、医学诊断及农业育种等诸多领域具有广泛而关键的应用价值。
分子杂交的典型流程主要包括三个核心环节：首先，需通过体外转录或酶促合成等方法制备高特异性和高活性的标记探针；其次，在严格控制反应条件下进行杂交过程，确保探针与目标核酸之间的高效、特异性结合；最后，借助相应的检测系统（如显色法或荧光法）实现杂交信号的可视化与定量或定性分析。本文拟从这三个核心环节来为大家详细介绍相关实验方法及原理。
一、探针制备
分子杂交中应用最广泛的探针有三种：荧光标记探针、生物素标记探针以及地高辛标记探针。不同标记物的探针，制备的方式也各不不同。
（1）荧光标记探针：即是将荧光染料分子（如FITC，Cy3，Cy5等）直接连接到RNA/DNA上，通常可利用T7 RNA聚合酶以体外转录的方式来对RNA进行标记或利用化学合成法将荧光分子直接嵌入到DNA链中。
（2）生物素标记探针：一般可通过DNA聚合酶、RNA聚合酶等酶类，将含生物素修饰的核苷酸（如Biotin-16- UTP、Biotin- 11-dUTP）掺入到探针中，适用于PCR产物、cDNA或RNA探针的标记。
（3）地高辛标记探针：常用的标记方法有随机引物法和PCR法。随机引物法标记效率高，但对模板的要求较为严格，需使用量大且纯度高的模板，否则会产生很多非特异性探针，代表性试剂主要为国际大牌Roche的DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit；PCR法就要相对简单许多，并且由于这种方法借助PCR仪本身就非常灵敏，所以哪怕模板量很少的情况下，也能进行很好的扩增，探针产量和纯度都要高于随机引物法，代表性试剂主要为国内知名品牌BIOG的地高辛标记试剂盒，其中使用的超级热启动Taq酶可确保最大程度上减少非特异性标记。
二、原位杂交
分子杂交技术依据检测目标与形式的不同，衍生出多种类型，如Southern印迹（检测DNA）、Northern印迹（检测RNA）、原位杂交、菌落杂交及斑点杂交等。其中，原位杂交技术因其能够在完整的组织或细胞中精确示踪特定DNA或RNA序列的时空分布，实现分子遗传信息与细胞形态学、组织结构的直接关联，故而成为应用最为广泛的技术之一。
原位杂交按照标记物分可分为放射性原位杂交（RISH）、普通（显色）原位杂交（CISH）和荧光原位杂交（FISH），由于放射性物质存在危害较大，目前普遍使用的是普通原位杂交与荧光原位杂交。
（1）普通原位杂交：是一种利用特定标记物（主要为地高辛或生物素）标记的核酸探针，与细胞、组织或染色体样本中互补的核酸序列在原位进行特异性杂交，然后通过免疫酶促反应产生不溶性的有色沉淀物，从而在普通光学显微镜下对特定基因或染色体区域进行定位和分析的技术。染色结果可长期保存，并且与常规HE染色的组织形态学背景对比更加清晰，易于研究者对杂交结果进行判读。
（2）荧光原位杂交：是一种利用荧光标记的核酸探针，与细胞或组织样本中互补的核酸序列在原位进行特异性杂交，从而通过荧光显微镜对特定基因或染色体区域进行定位、定性和相对定量的技术。细说的话，荧光原位杂交实验也有直接法与间接法之分，其应用都十分广泛。
·直接法即是直接使用荧光标记的核酸探针进行FISH实验，杂交后便可观察荧光来判断结果；
·间接法则是先使用地高辛/生物素标记探针进行杂交，再进一步使用亲和素或地高辛抗体标记荧光素使探针再带上荧光标记，如此一来即可实现荧光原位杂交，并且该种方法具有级联效应，可以将杂交信号二次放大，具备更高的检测灵敏度。另外，想要检测多个基因，该种方法相比于直接法会更加合适，原因是亲和素标记的荧光素种类比能直接标记到探针上的荧光素种类要更多，因此研究者拥有更加灵活的选择空间，Fish实验整体的灵敏度也能得到提升。目前，市场上做该类型Fish实验的试剂盒品牌只在极少数，研究者可优先选择像百代生物这样的龙头企业品牌，产品性能更有保证，并且使用该试剂盒，研究者可省去繁琐的预杂交步骤，实验流程更简便的同时实验效率也能得到显著提升。
三、杂交检测
根据标记物不同，杂交检测的原理与方式也各不相同。
1、荧光标记探针检测
采用荧光标记探针进行的杂交实验，检测时仅需利用自身携带的荧光基团，在受激发光后发出特定波长的荧光，直接通过荧光显微镜、激光共聚焦扫描仪等仪器即可观测荧光信号的分布位置，是最快速最简便的检测方式。
2、生物素标记探针检测
生物素标记探针的检测核心依赖于生物素与（链霉）亲和素之间超高强度的特异性结合。在各类膜杂交实验中，如Southern印迹、Northern印迹、斑点杂交、菌落杂交等等，生物素探针的应用与检测可谓十分常见。最常用的检测方法要数化学发光法，在杂交后使用HRP标记的链霉亲和素与样本进行孵育，使之与生物素标记探针结合，再利用ECL化学发光检测试剂进行检测即可。如果目标分子丰度极低，建议选择配置有超敏飞克极别化学发光液的生物素标记核酸检测试剂盒，像Roche、BIOG等，其检测灵敏度较普通ECL配方要高出10倍以上，即使是极微量的目标分子也可检出。
在原位杂交实验中，研究者则常常通过荧光检测法来检测，该方法尤其适合于需要对杂交信号进行二次放大的实验，例如以生物素标记探针进行的原位杂交实验，通过孵育亲和素标记荧光素（FITC-Avidin、Cy3-Avidin等等）后，可直接在荧光显微镜下进行结果观察，由于多级放大效应，该方法的灵敏度要更高，检测起来也非常方便。
3、地高辛标记探针检测
地高辛标记探针的检测依赖于免疫酶促反应，该策略巧妙结合了半抗原-抗体反应的高特异性与酶催化反应的高灵敏度。杂交反应完成后，使用抗地高辛抗体孵育样本。根据抗体上所偶联酶的不同，可分为两种检测体系：一是Dig–HRP（辣根过氧化物酶）系统，以DAB为底物，反应后产生棕色沉淀；二是Dig–AKP（碱性磷酸酶）系统，采用BCIP/NBT作为底物，反应生成蓝紫色沉淀。在酶促显色性能上，AKP体系的灵敏度和分辨率通常约为HRP的10倍，因此尤其适用于普通原位杂交实验，可直接通过肉眼观察探针的杂交分布情况（图2）。
若需进一步提高检测灵敏度，可选用CDP-STAR等化学发光底物。不过，CDP-STAR的合成工艺较为复杂，目前国内仅有少数公司如BIOG等品牌能够提供。该方式更适用于Southern、Northern、菌落杂交或斑点杂交等免疫检测应用。
