题目：A single-cell survey of cellular hierarchy in acute myeloid leukemia
发表期刊：Journal of Hematology & Oncology (IF:23.2)
发表年份：2020-09

摘要

Background:急性髓系白血病（AML）是一种致命的造血恶性肿瘤，其预后与遗传复杂性相关。目前尚未有从单细胞水平对不同 AML 亚型进行综合分析。
Methods:使用Microwell-seq平台，分析了来自40名患者和3名健康供体的骨髓样本的单细胞转录组测序。还使用single-cell single-molecule real-time (SMRT)测序来研究AML细胞的克隆异质性。
Results：通过对191727个AML细胞的数据分析，建立了一个单细胞层面的AML“景观”，并鉴定了一群具有新型AML marker的AML祖细胞群体,推断出两种具有不同临床结局的AML亚型。联合 Microwell-seq 和 SMRT sequencing探究AML中的线粒体突变。且提出存在一种表型“cancer attractor”, 这可能有助于定义AML祖细胞具有的共同表型。最后，通过比较AML landscape和Human Cell Landscape来探索潜在的药物靶点。
Conclusion:他们鉴定出了一群的AML祖细胞群。核糖体蛋白基因水平高表明提示病人预后不良。还推断出具有不同临床结局的AML亚型，并探索了潜在的药物靶点。这些结果表明AML存在cancer attractor。

实验设计及质控

样本： 40 病人和3个健康对照人的骨髓单核细胞(BMMC,Bone marrow mononuclear cell)
细胞：

结果

1.正常人BMMC单细胞分析

使用了Microwell-seq对三个健康供体BMMC进行分析(Figure 1A and B).

Figure 1A and B

鉴定了3种主要的细胞群体：淋巴细胞、红细胞和髓系细胞(Figure1 A 和C).

Figure 1C

中性粒细胞再细分为6类细胞亚群, neutrophil A, neutrophil B, neutrophil C, neutrophil Dneutrophil Eneutrophil F 和neutrophil G(Figure S2).

Figure S2

为了进行lineage trajectory分析，从既往的研究中(数据ID号：GSE92274)整合了额外的2000个造血干/祖细胞（HSPC, hematopoietic stem/progenitor cells）和2719个外周血单核细胞（PBMC, peripheral blood mononuclear cells），总共获得13280个健康对照人的细胞，使用partition-based graph abstraction (PAGA),构建健康人的造血分化轨迹景观(Figure 1D,E and F)

Figure 1D,E and F

2.鉴定初发AML的造血细胞群体

对40个AML样本和3个健康对照样本进行批次矫正后，得到20个亚群。中性粒细胞，单核细胞，红系细胞和淋巴细胞都可在AML样本和正常样本中找到(Figure 2A and B).但是中央有一团细胞无特异性的基因表达(Figure 2C).

Figure 2A, B and C

网络图提示这群团细胞与髓系细胞很靠近，相关性图提示这群基因与HSPC相关，因此这群细胞定义为AML progenitor cells.

Figure 2D and E

3.AML progenitor cells的特征

与髓系细胞相比，AML progenitor cells和HSPC有许多共同的上调基因，尤其是核糖体蛋白基因(RP,ribosomal protein genes,Figure 3A).通路富集分析显示AML祖细胞具有较高的RB基因转录活性（图。(Figure 3B).

Figure 3A and B

尽管存在RP基因表达的相似性，但是一些基因在HSPC，，AML progenitor cells和髓系细胞中的表达差异还是比较大的。

基因表达模式显示AML progenitor cells处于从HSPC到分化的髓系细胞的“中间状态”。具体来说，AML progenitor cells中的GATA2、SPI1（和MPO的表达水平处于中间水平(Figure 3D)。然而，一些参与primitive state 的基因在AML progenitor cells表达最高，如SOX4、FOS和ITM2A (Figure 3E).此外，CD99、CFD、RACK1、FTL、B2M和ADA在AML progenitor cells中表达量较高，先前已经有研究发现这些基因与AML存在关系(Figure 3F).而且有基因一些与实体瘤相关的基因，这些基因与AML的关系目前尚无报道，例如TMSB10、SH3BGRL3、MGST1、MRPL33和MARCKSL1基因(Figure 3G)

Figure 3D, E and F

接着用VIPER（Virtual Inference of Protein-activity by Enriched Regulon）分析，以揭示AML progenitor cells的转录因子（TF）活性。与HSPC相比，髓系细胞中差异表达的TF因子包括SPI1、KLF5和JDP2，而这些基因都参与造血发育的过程(Figure S7B).（F

Figure S7B

然而，参与恶性肿瘤的TF，如SMARCC1、HOXA9和HOXB3，在AML progenitor cells是活跃的(Figure 3H).

igure 3H

4.AML progenitor cells的瘤内异质性可预测预后

AML progenitor cells比例在病人异质性很大(Figure S5A).

Figure S5A

将AML progenitor cells分为16个亚群，并将其归纳为4大类。Clusters1、2、3、4和11为RP gene high clusters。其余3种包括neutrophil-like, monocyte-like, and myeloid cell-like clusters (Figure 4A and B)

Figure 4A and B

一般来说，这种聚类方法与FAB(French–American–British)分类一致.但是基于单细胞转录组数据揭示AML progenitor cells的功能状态会更详细。例如，M5患者可继续分为4个clusters，C5、C9、C12和C1(Figure S8A).

Figure S8A

富集分析表明，在RP gene high clusters中，C1和C2在调节肌动蛋白细胞骨架中起作用。C4与P53通路有关。C11富含癌蛋白聚糖。在neutrophil-like种，C5和C15与IL-17信号通路和癌症翻译失调有关。C7和C8富含MYC通路(Figure 4C).

Figure 4C

Figure S8D

使用WGCNA探索AML progenitor cells的基因调控网络，鉴定了18个模块（Figure S8E）。其中，一个模块由RP基因主导（Figure S8F).

Figure S8E and F

接着展示了这个模块的基因网络。该模块中的所有RP基因都可以在RP gene high clusters中找到(Figure 4D)

Figure 4D

该模块中的基因与各种肿瘤通路密切相关，提示这些基因参与AML的进展(Figure 4E).

Figure 4E

5.AML progenitor cells对于从AML的诊断和复发的临床意义

接着观察治疗前后的细胞比例变化，将N02作为对照，在缓解样本中(P-extra 1队列)，治疗后的大多数细胞与正常细胞的重叠，其中AML progenitor cells和增殖细胞的数量减少，而中性粒细胞增加(Figure 5A-B). 髓系亚群基因在正常细胞中高表达，而AML progenitor cells 基因主要在P-extra 1队列治疗前的队列表达(Figure 5J). 在缓解的样本中，RP和primitive genes在治疗前表达量高，治疗之后却比较低，中性粒细胞基因则表现出相反的趋势(Figure 5J).在复发样本中（P20 队列），骨髓中AML progenitor cells 占主导地位，RP和primitive genes在治疗前和治疗后表达量均高(Figure 5K).

Figure 5A-F

Figure 5J-L

6.单核细胞白血病的瘤内异质性

然后，将分析重点放在一种亚型AML-M5上，并整合了15种单核细胞白血病的数据。在此研究中，P06、P14和P16是难治型AML患者；其余12例为非难治性患者。
AML祖细胞在患者中的比例差异很大（Figure S11A）。随机选择了12000个细胞难治型样本（C5）和非难治性患者（C13）分析（Figure S11B-E）。GSEA表明与C13相比，MYC、SRC、RELA、原癌基因MTOR相关通路在C5中过表达，表明C13恶性程度更高（Figure S11F）。TCGA-AML中，SRC和MTOR的高表达水平提示预后较差（FigureS11G）。GO分析揭示了
C5中的TF，如CEBPG、GATA2、MAX和
JUN基因集在C5中处于激活状态，而CEBPE、GATA1、MAZ、，

和JUND基因集在C13处于激活状态（FigureS11 H and I）.

Figure S11

7.单细胞水平SMRT测序与遗传突变的关系

由于覆盖范围的限制，3′端的单细胞转录组分析未能识别基因突变。因此，将 long-read sequencing与Microwell seq实验相结合。我们使用靶向上游引物和通用下游引物从单细胞cDNA中扩增特定基因进行SMRT测序，可以获得mutation sites and cell barcodes(Figure 6a).既往研究报道，mtDNA突变可提供 innate and natural barcodes来推断细胞的克隆进化。他们选择线粒体基因MT-ND4，使用SMRT测序进行谱系追踪。从P25、P10和P17样本的单个细胞中鉴定到了MT-ND4的异质变体。过滤后，以MT-ND5转录本为参考，得到平均3406个读数。突变位点的平均测序深度为3041。其中，UMAP聚类后，每个样本约有711个read。接着将这些细胞分为几个亚克隆（Figure S12A-C）。采用monocle3包，描绘了髓系、红系和淋巴系的分化轨迹(Figure 6B and Figure S12D and E)。这些亚克隆与细胞表型的相关性很差。在不同的细胞亚群中检测到所有MT突变的亚克隆，这表明多个细胞克隆可能有助于AML分级，不同的细胞可能在AML中属于相似类型的“attractor”(Figure 6C and Figure S12 D-E).

接着使用ARACNe和VIPER的算法来进行基因网络分析。Figure 6D and E显示了在P25患者中，与HSPC细胞相比，AML祖细胞、AML（E）和正常（f）髓系细胞的attractor网络核心基因。MYB、RUNX2和YY1是P25的AML祖细胞独有的attractor，可能是诱导癌症的决定因素。P10和P17也有自己的attractor网络.(Figure S12 F-I).(

Figure 6

Figure S12

8.结合HCL 数据库探究AML靶点

分析AML landscape和Human Cell Landscape两者的数据后，差异分析得到了AML中高表达基因。在前10个基因中，FLT3是众所周知的，POU4F1也有报道。其中有一半基因是lncRNA。其他是PRSS21、CCL1和DNTT(Figure 7A)。相关分析显示，这前10个基因与AML中最相关的基因一起属于两个网络(Figure 7B)。RP基因在这两个网络中都起着重要作用。接着，研究了AML祖细胞群中的前5个相关蛋白编码基因，这些基因与肿瘤或髓系分化相关(Figure 7C).

Figure 7

结论

研究中使用Microwell-seq分析了来自40名AML患者的191727细胞，以建立单细胞层面的AML景观。鉴定出具有新型AML标志物的恶性AML祖细胞亚群。祖细胞RP基因高表达的患者的缓解率较低。推断出两种具有不同临床结局的AML。我们表明，单细胞分析可用于预测和评估AML治疗效果。最后，通过将Microwell-seq与SMRT测序相结合，追踪了AML景观中的线粒体突变，并证明了AML克隆与转录组表型之间缺乏关联。总体研究表明“cancer attractor”的存在可能有助于定义AML祖细胞的共同表型。

急性髓系白血病单细胞层次的研究