研究概述：肝细胞癌(HCC)是最常见的原发性肝癌类型，也是全球癌症相关死亡的第二大原因。HCC相关的高死亡率很大程度源于其高转移性，肿瘤转移表现为肿瘤细胞从原发病变部位通过基底膜(basal membrane, BM)向远处器官渗透，形成新的转移灶,基底膜的重塑或损失(BM)是肿瘤细胞实现转移的重要因素。TME与肿瘤发生、肿瘤细胞逃离免疫系统，以及肿瘤的疗效和临床预后密切相关，肿瘤转移累及BM的机制已被证明与TME密切相关。尽管肝癌的靶向治疗和免疫治疗取得了进展，但晚期HCC的耐药性高和有限的疗效问题，急需更好的治疗选择和早期诊断生物标志物。虽然有重要的研究调查了TME对肝癌的影响，但免疫细胞是否可以通过机械修饰BM来增强HCC的侵袭仍未完全了解。为此，作者旨在通过寻找和评估潜在基底膜与转移相关的生物标志物来解决这些空白，以改善HCC患者的生存结果和治疗效果。本研究首先收集了来自TCGA的424例HCC患者和ICGC数据库的240例HCC患者的转录组测序、临床和突变数据，基于转移和基底膜相关基因(base membrane-related genes, MBRGs)，利用大量数据分析，构建并验证了一个由12个基因组成的肝癌预后模型。然后，使用免疫相关算法来检查高风低风险组的肝癌免疫微环境情况，并进一步分析免疫治疗的敏感性。此外，使用肝癌单细胞RNA测序结果，分析了其中一个MBRGs——整合素亚单位α 3 (ITGA3)在HCC中的表达。最后，通过相关细胞实验来阐明ITGA3在人肝癌HepG2细胞侵袭中的新作用。下图为其研究工作流程图：

研究结果如下：

1.基于转移和基底膜相关基因，鉴定出12个肝癌相关预后基因

研究从TCGA数据库中获得了424例TCGA-LIHC患者样本(374例肿瘤和50例正常)，包含59,427个基因(FPKM)，采用log2 |Fold change|≥1和FDR < 0.05的筛选标准进行肿瘤组和正常组的方差差异分析，获得TCGA-LIHC中获得了13095个差异基因（DEGs）。另外从HCMDB数据库中获得了2165个转移基因，从先前的研究中获得了224个BM基因，然后对TCGA-LIHC中13095个差异基因、2165个转移基因和224个BM基因进行交叉分析，得出35个在肝癌中共表达的与转移和基底膜相关基因（图2A）。35个基因中，32个基因上调，3个基因下调(图2B)。随后，对这35个差异表达的转移与BM交叉基因进行单因素Cox回归分析，鉴定出12个预后基因，均与OS显著相关，HCC的风险比均> 1(p < 0.05)。此外，12个预后基因在肿瘤组织中表达上调(图2C, D)。结果提示12个预后基因的高表达预示着不良的预后。接下来，评估HCC预后基因的突变状态和CNVs的发生率，在371例HCC病例中，35例(9.43%)发生转移和脑转移相关基因突变，包括ROBO1(3%)、ITGB5(2%)、ITGAM(1%)、ITGA3(1%)、ITGAV(1%)、ITGA2(1%)和MMP14(1%)(图2E)。此外，CNVs在大多数预后基因中普遍存在。其中，ITGA3和ITGA2主要被扩增，ADAM9、ITGAM、MMP1和MMP14主要被缺失(图2F) 。

2.基于TCGA数据库构建MBRG预后评估模型

利用单变量Cox回归分析得到的12个预后基因，我们进一步利用多变量Cox回归分析建立了基于这12个MRBGs的预后模型，风险评分采用下式计算，其中exp.表示相应MBRG的表达水平:Riskcore =(0.556∗UNC5B exp.)+ 0.1291(∗ROBO1 exp.)+ 0.1482(∗MMP14 exp.)+ 0.7548(∗MMP1 exp.)+ 0.3003(∗ITGB5 exp.)+ 0.4213(∗ITGAV exp.)+(−0.2984∗ITGAM exp.)+(−0.3605∗ITGA5 exp.)+(−0.7239∗ITGA3 exp.)+(−0.1902∗ITGA2 exp.)+ 0.9724(∗CD151 exp.)+ 0.6254(∗ADAM9 exp.)，使用风险评分中位数,我们分类的病人到低收入和高危人群。在TCGA数据集中，我们观察到低危组的生存期明显长于高危组(图3A)。此外， ROC曲线显示，基于MBRGs的预后模型具有较高的可靠性，1年、2年和3年的曲线下面积(AUC)分别为0.749、0.714和0.706生存率分别为(图3B)。风险评分和生存状态分析显示，低风险组表现出良好的生存结果，生存期延长。此外，所有风险基因在高危亚组中均上调(图3C)。PCA和t-SNE分析显示，两个亚组的患者进一步分为两种分布模式(图3D)。这些结果表明，MBRGs预后模型可用于准确预测HCC患者的临床发展轨迹。

3.ICGC数据库中MBRGs预后模型的验证

采用ICGC数据库中的LIHC-JP队列作为验证组，评估MBRG预后模型在训练队列中的普遍性，利用上述TCGA队列相同的公式计算验证队列中每位患者的风险评分。结果显示，高危组患者的生存状况明显差于低危组(p = 0.001)(图3E)。此外，ROC分析显示，MBRG预后模型的1年、2年和3年生存率的AUC值分别为0.728、0.731和0.683(图3F)。风险评分与生存状态分析，12个基因的表达高组其风险评分增加和死亡率升高 (图3G)。PCA和t-SNE在两个风险亚组之间显示出明显的方向性分布。

4.MBRGs预后模型与临床特征的相关性分析

进一步分析MBRGs预后模型在TCGA队列中不同临床因素分组中的价值，肿瘤分级、分期、T期越高患者风险评分较高(p < 0.05)(图4A-C)。此外，我们发现高危组更容易发生血管侵犯(p < 0.05)(图4D)，并且在淋巴结阳性和远处转移的患者中观察到风险评分增加的趋势(图4E, F)。

5.风险评分的独立预后分析和预测模态图模型的构建

采用单因素和多因素Cox分析探讨LIHC的独立预后因素,结果显示，风险评分和分期与OS显著相关，提示TCGA-LIHC队列构建的MRBG预后模型的风险评分是HCC患者的独立预后因素(p < 0.01)(图5A, B)。因此，我们创建了一个基于HCC独立预测指标的模态(图5C)来更准确地评估患者预后。此外，校准曲线(1年、2年和3年)在模态图的内部验证中表现出良好的性能(图5D)。如图5E、F所示，模型与临床信息相结合具有较好的预测能力，AUC为0.790。总之，将基于MBRGs的HCC患者预后模型与临床信息相结合，成功构建了具有更高可信度和准确性的预后模型。

6.HCC的MBRGs评分与EMT活动呈正相关

在内皮间质转化过程(EMT)中发生的BM丢失被认为是肿瘤转移和恶性发展的关键步骤，这促使我们研究MBRGs评分与EMT途径之间的相关性。KEGG和GO富集分析显示，先前鉴定的DEGs在许多与免疫和肿瘤转移相关的途径中显著富集(图6A-B)。在GSEA中，高危亚组主要富集于细胞增殖相关通路，低危组主要富集于细胞代谢相关通路(图6C)。这些结果揭示了基底膜在HCC进展和转移中的重要性。值得注意的是，GSEA结果提示高危亚组预后不良的主要原因是细胞增殖。最后，散点图的相关分析显示，EMT通路与MBRG ITGA3的表达之间存在很强的正相关(图6D)。

7.不同组LIHC患者的免疫学分析

为了进一步探讨MBRG s评分与免疫状态的相关性，我们使用ssGSEA评估了TCGA高危组和低危组16种免疫细胞类型的富集评分，结果显示免疫细胞浸润在两个亚组之间存在显著差异，如激活的树突状细胞、树突状细胞、巨噬细胞和Tregs在高危亚组中显著富集，而B细胞、肥大细胞、自然杀伤(NK)细胞和其他免疫细胞在低危亚组中主要富集(p < 0.05)(图7A)。此外，在免疫功能方面，高危组MHC_I水平较高，低危组细胞杀伤活性和II 型干扰素水平较高(p < 0.05)(图7B)。此外，ITGA3的表达与巨噬细胞、Tregs等多种免疫细胞和免疫功能呈正相关(p < 0.05)(图7C-E)。这些结果揭示了ICGC和TCGA队列之间相似的免疫状态，提示高危组患者预后不良可能是由肿瘤相关巨噬细胞状态和Treg水平高以及NK细胞水平低引起的。

8.基于MBRGs评分，进行肿瘤突变负荷和免疫治疗反应等评估

考虑到肿瘤突变负荷（TMB）值、肿瘤免疫功能障碍和排斥(TIDE)评分、突变频率、免疫检查点基因表达与免疫治疗的疗效密切相关，在高危组和低危组均基于MRBGs进行估计。TMB量化分析显示，高危组TMB值更高(图8A)。如图8B所示，高危组的TIDE评分较低，表明免疫障碍的可能性较低。随后，我们使用“mafTools”R包进一步研究了前15个基于TCGA的体细胞突变在高、低风险组之间的分布格局(p < 0.01)。TP53是两个亚组中最常见的突变基因，高风险组的突变频率比低风险组高18%(图8C, D)。此外，TTN、LRR1B和OBSCN在高风险组中显著上调，CTNNB1在低风险组中显著下调。总的来说，高风险组在所有因素中有更高的突变频率，表明免疫治疗有更大的影响。此外，对免疫检查点阻断因子在高危组和低危组之间表达差异的进一步研究显示，PD-1、CTLA4和PD-L1在高危组中高表达(p < 0.05)(图8E)。综上所述，高危组TMB值较高，突变频率较高，免疫检查点基因表达增加，TIDE评分较低，提示高危组可能具有更好的免疫治疗效果。

9.基于MBRGs进行肝癌治疗药物敏感性分析

为了确定HCC患者的潜在治疗药物，我们使用算法来探索HCC患者的MBRGs风险评分与四种常用抗癌药物(阿西替尼、安洛替尼、索拉非尼和苏尼-替尼)的反应之间的相关性。通过计算这些药物在低风险组和高风险组中的IC50值，发现低风险组患者对阿西替尼、厄洛替尼和索拉非尼表现出更大的敏感性，而高风险组患者对舒尼替尼的敏感性增加(图9A)，IC50值与阿西替尼、厄洛替尼、索拉非尼与风险评分正相关，以及舒尼替尼的IC50值与风险评分之间呈负相关(p < 0.001)。此外，我们从Drugbank数据库中获得了靶基因，并基于靶向治疗评估了它们在两个危险组中的表达，两组间所有靶基因的表达均有显著差异(p < 0.05)(图9B)。这些发现表明，MBRGs风险评分可以区分哪些患者更适合适当的治疗。

10.ScRNA-seq分析及PPI网络的构建

由前文获知ITGA3是高预后基因，可能在肝癌发生发展中起着至关重要的作用，为了进一步在单细胞水平上探讨ITGA3在HCC中的作用，我们由TISCH 2.0数据库收集了肝癌组织的scRNA-seq分析，结果示了ITGA3在恶性肝细胞中的高表达（图10A-F）。恶性细胞中ITGA3的表达水平明显高于肝细胞，且与HCC预后不良有关。为了阐明蛋白质之间的共表达和相互作用，我们选择了高预后基因ITGA3进行进一步分析，并使用以该因子为中心的GeneMAINA数据库构建了PPI网络，结果示有20种蛋白与ITGA3相互作用，其中ITGB1与ITGA3的相关性最高(图10G)。

11.ITGA3在HCC细胞的迁移和侵袭中起着至关重要的作用

前文研究揭示了MBRG与EMT通路之间存在很强的正相关，其中ITGA3是相关性最强的MBRG。然而，该基因对HCC增殖和迁移的影响尚未见报道。由于ITGA3在HepG2细胞中表达水平较低(图11A)，因此使用过表达载体来分析其在HCC中的潜在作用，RT- qPCR结果显示，转染ITGA3- oe慢病毒后，ITGA3的表达显著上调(图11B)。CCK-8实验结果表明，过表达ITGA3不影响HepG2细胞的增殖(图11C)。接下来，利用划痕实验和Transwell迁移实验，发现过表达ITGA3增强了HepG2细胞的迁移能力，侵袭细胞数量明显增加(图11D-G)。此外，来自HPA数据库的免疫组化结果显示，ITGA3在肿瘤中的表达高于正常组织(图11H)。这些结果表明，ITGA3在HCC细胞的迁移和侵袭中起着至关重要的作用。

研究总结：

本研究结合肿瘤转移和肿瘤转移两个特征构建了一种新的生物标志物，建立了一种基于MBRGs的12个相关基因的肝癌新型预后模型，可有效预测患者的转移、预后和免疫治疗效果，有助于指导医生为HCC患者制定更准确和个性化的治疗决策，并特别提出了ITGA3在HCC细胞的迁移和侵袭中起着至关重要的作用，并有望开发出新的潜在药物，研究结果为肝癌基础研究提供了新的理论支持。