导读由拟轮枝镰孢（Fusarium verticillioides，Fv）引起的茎腐病是玉米生产中最具破坏性的病害之一。根系对Fv入侵的防御反应对植物的生长和发育非常重要。剖析根细胞类型对Fv感染的特异性反应及其潜在的转录调控网络将有助于了解玉米根系对Fv入侵的防御机制。在****本研究中****，****研究者****报告了接种Fv和模拟条件的两个玉米近交系根尖上29217个单细胞的转录组，并确定了7种主要细胞类型和21个转录不同的细胞簇。通过加权基因共表达网络分析，研究者从4049个差异表达基因（DEGs）中确定了12个Fv响应调控模块，这些模块在这七种细胞类型中被Fv感染激活或抑制。利用机器学习方法，研究者整合了细胞类型特异性转录组中由Fv诱导的DEGs、16个已知的玉米抗病基因、5个实验验证基因（ZmWOX5b、ZmPIN1a、ZmPAL6、ZmCCoAOMT2和ZmCOMT）以及42个与Fv抗性相关的QTL或QTN预测基因，构建了6个细胞类型特异性免疫调节网络。综上所述，本****研究不仅提供了根系发育过程中玉米细胞命运决定的全局视角，而且还以单细胞分辨率深入揭示了玉米根尖主要细胞类型的免疫调节网络，从而为剖析玉米抗病性的分子机制奠定了基础。

****论文ID****

原名：Single-cell RNA sequencing profiles reveal cell typespecific transcriptional regulation networks conditioning fungal invasion in maize roots

译名：单细胞RNA测序图谱揭示了调控玉米根部真菌入侵的细胞类型特异性转录调控网络

实验设计

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结果

1 拟轮枝镰孢菌在玉米幼苗根系中的感染性建立

与玉米茎腐病抗性近交系Qi319相比，玉米易感茎腐病的近交系B104植株在接种Fv后，根部和茎秆内部的腐烂症状更为严重（图1a），SRSA（茎腐病平均得分）和DSI（病害严重性指数）也显著增加（图1b）。为了观察Fv在玉米根内的增殖过程，****研究者****将Fv菌丝接种于Qi319和B104两个品系的主根尖，并在26****℃****下培养。两个品系的病害严重程度和病害发展速度各不相同。就Qi319而言，直到接种后36小时（hpi），根部的病变区域才出现轻微病变，病根总体健康，病变轻微，呈浅褐色，到48小时（hpi）病变未出现萎缩症状。与此相反，受感染的B104根早在18 hpi就出现了浅褐色病斑，并逐渐扩大，在36至48 hpi长达约10mm，导致约80%的B104根在48 hpi前出现深褐色的严重坏死病斑，并出现萎缩症状（图1c，图S1a-h）。在24和48 hpi时，B104根的平均DSI分别为Qi319根的5.58倍和2.32倍，明显高于Qi319根（图1d）。

虽然茎腐病菌Fv直接接种到根尖（包括RAM），但在接种后的不同时间点，病害症状总是出现在根尖上部，而不是RAM上部（图1c，图S1a-h）。实际上，在48 hpi时，病部位于菌丝接种塞的位置（图S1h）。随着时间的推移，病害扩展到接种根的中部。为了证实观察结果并评估玉米根部症状发展与Fv定殖之间的联系，采用WGA-AF488（小麦胚芽凝集素-Alexa****Fluor488共轭物）染色法监测Fv菌丝的扩散。Fv的纵向迁移是通过测量根尖与菌丝之间的距离（DTH）来评估的，而WGA信号则是通过测量绿色荧光的面积密度[IOD（综合光密度）/面积]来评估的。

对于Qi319来说，到48 hpi时，Fv菌丝主要在根尖上方约10-12mm的内皮层和周缘区域被检测到，在接种根的下部没有观察到菌丝。然而，在相同的时间跨度内，接种的B104根中的菌丝比Qi319根中的菌丝扩散得更快、更广（图1e,f）。在距离B104根尖近6-12mm的位置捕捉到了Fv菌丝的入侵，其中扩散区域包括根的茎干、内皮和表皮，在纵向切片的上部，甚至部分皮层也充满了Fv菌丝（图1e,f）。在分别距根尖约7mm和12mm处采集的横向切片染色结果进一步证实了这些观察结果（图1g,h）。

研究者****通过研究叶片和根系对Fv侵染的生理生化指标的变化（图1i-k），也对这两个近交系进行了表征。一般来说，B104幼苗在受到Fv感染后，ROS（活性氧）包括H2O2和MDA（丙二醛）的水平较高（图1i1，图S1i），而在Qi319幼苗上观察到CAT（过氧化氢酶）、POD（过氧化物酶）、SOD（超氧化物歧化酶）和PPO（多酚氧化酶）等抗氧化酶的活性较高（图1j）。同样，抗性品系Qi319的ROS清除剂脯氨酸的含量在Fv感染后也有所增加（图1i2）。此外，与B104幼苗相比，Qi319幼苗暴露于Fv后总蛋白（TP）和水溶性糖（WSS）的浓度、苯丙氨酸氨解酶（PAL）的活性以及木质素（PAL相关代谢物之一）的含量都有更大幅度的增加（图1k，图S1i）。

总之，在抗性品系（Qi319）和易感品系（B104）的接种根中，Fv只在RAM区域上方扩散，这表明包括干细胞和QC在内的RAM对Fv的入侵具有抗性。因此，本研究在48**** hpi****采集了根尖约5mm长的根组织，这些根组织没有Fv侵染，包含根冠****（****RC****）****、根尖分生组织****（****RAM****）****和伸长区****（****EZ****）****，并用于随后的scRNA-seq分析。

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图1.拟轮枝镰孢菌（Fv）在玉米幼苗根部的感染建立过程。（a）抗性（Qi319）和易感（B104）玉米植株茎秆受Fv感染后的纵切面图像。（b）通过计算茎秆腐烂平均得分（SRSA）和病害严重程度指数（DSI），比较Qi319和B104玉米植株的茎秆腐烂抗性。（c）玉米幼苗根部在48 hpi感染Fv后出现的腐烂症状。虚线框内的图像是红色箭头所指病根区域的放大图。比例尺=2cm（虚线框内为5mm）。（d）Qi319和B104分别在24和48 hpi时的DSI比较。（e-h）48 hpi时通过WGA-AF488染色监测Fv菌丝的扩散。用WGA-AF488对Fvin接种的玉米根进行染色后，Fv菌丝呈绿色，而用碘化丙啶（PI）对细胞壁进行染色后，则呈红色。观察方法是分别对长度为10-12mm、厚度为5μm的纵向切片（e）和距根尖约7和12mm的横向切片（g）进行染色。通过测量根尖与菌丝（DTH）前进前线（f）之间的距离来评估Fv的纵向迁移。通过测量绿色荧光的面积密度来评估纵向切片（f）和横截面（h）的WGA信号。面积密度以每面积的IOD（综合光学密度）表示。比例尺=1mm（e）和300μm（g）。（i-k）Fv接种后Qi319和B104生理生化指标的测定。分别在接种后0、12、24、36和48小时收获Fv和模拟（MK）接种的根（R）和叶（L）。（i）过氧化氢（H2O2）含量（i1）和ROS清除剂脯氨酸含量（i2）；（j）抗氧化酶活性，包括过氧化氢酶（CAT）（j1）、过氧化物酶（POD）（j2）、超氧化物歧化酶（SOD）（j3）和多酚氧化酶（PPO）（j4）；（k）苯丙氨酸氨解酶（PAL）活性（k1）和木质素含量（k2）。数值为平均SD值。对于（b）、（d）、（f）和（h），P＜0.05、P＜0.01和****P＜0.001（配对学生t检验）。对于（i-k），经Tukey-Kramer检验，列上不同字母表示差异显著（P＜0.05）。

2 玉米根尖细胞图谱的生成

为了对玉米根进行scRNA-seq，****研究者****在48**** hpi****时从接种Fv的Qi319和B104幼苗根尖分离玉米原生质体。用单细胞反应试剂（图S2a，表S1）初步混合了总共38145个细胞，并构建了10×Genomicssc RNA-seq文库（图2a）。数据在细胞和基因水平上都进行了筛选，最终形成了一个包含29217个细胞和32224个基因的文库，用于进一步分析（表S1）。在8个样本中，每个细胞的基因中位数从1456个到2699个不等，每个细胞的唯一分子标识符中位数从2245.5个到11005个不等（表S1）。两个生物重复的scRNA-seq数据之间的高相关性（Spearmanr=0.94至0.97）表明数据质量具有可重复性（图S2b）。此外，scRNA-seq数据与块根mRNA测序数据的相关性（r=0.69至0.75）也相对较高（图S2b），表明scRNA-seq的可靠性和玉米根原生质体提取的有效性。

线性降维后，研究者****使用t分布随机邻域嵌入（t-SNE）工具对scRNA-seq数据进行可视化和解释。无监督分析将玉米根细胞分为21个簇（图2b）。经过差异分析，在这21个簇中共鉴定和定义了1950个细胞类型标记（表S2）。由于只有少数实验结果验证了标记基因可用于区分玉米根细胞类型，为缓解这一问题，研究者对数据进行了挖掘，以确定在一个或两个簇中高表达和特异表达的潜在标记基因（图2c、d，表S2），并利用近期相关参考文献中的可用信息选择细胞类型特异性标记基因。为了在体内验证候选标记基因，****研究者****进行了RNA原位杂交，并确定了用于区分玉米根细胞类型的可靠的细胞类型特异性标记（图2e、f，图S3）。

例如，bZIP17、TIP1-1、Zm00001d003283和Zm00001d017508在皮层细胞中特异表达；Zm00001d046187在内皮细胞中特异表达；Zm00001d033711在表皮细胞中特异表达；Zm00001d049683、UCC3和Zm00001d051333在中柱细胞中特异表达。半胱氨酸蛋白酶5（CCP5）和Zm00001d032501只在中木质部细胞中表达（图2e、f；图S3）。木质部半胱氨酸肽酶1（XCP1）和与CCP5同源的XCP2是拟南芥中编码木质部特异性半胱氨酸蛋白酶的基因。此外，在之前的研究中，CCP5也被用作中木质部的标记基因（表S3）。同时，38个标记基因在一个或几个群中特异表达，因此可用于根细胞类型的分类（图2d）。例如，木质部标记基因纤维素合成酶13（CESA13）在第19簇中特异表达（图2d，表S3），之前的一项研究一致。

组蛋白基因H4C7、H4C7.2和his2b1在第18簇（RAM）中高积累，Zm00001d020794和Zm00001d049606在第13组（RC）中高表达（图2c、e，图S3b、c）。据报道，一系列组蛋白基因也参与了RAM的发育。此外，RAM和RC簇间DEGs的GO和KEGG功能差异也证明了它们各自的细胞命运。具体来说，相对于簇18，簇13上调的DEGs显著富集于17个生物过程（如：核小体组装、染色质组织、核糖体组装等）、图S2c，表S4）。相反，相对于簇13，簇18上调的DEGs显著参与了与RC发育相关的50个GO生物过程和一个KEGG通路（图S2d，表S4）。

总之，使用t-SNE投影法发现了七大细胞群，包括皮层（簇0、1、6、8、9、11、12、15和16）、内皮层（簇5和17）、表皮层（簇2、4和7）、****中柱****层（簇3、10、14和20）、木质部（簇19）、RAM（簇18）和RC（簇13）（图2g）。皮层是最大的细胞群，包含14305个细胞。中柱层、内皮层和表皮层是主要的细胞群，包含2588到6123个细胞，而在RC、中木质部和RAM中观察到少量细胞（413-758个）。在每种同源细胞类型中，研究者发现在Fv处理和模拟条件下，B104和Qi319七种细胞类型共有79%-95%的表达基因（图S2e,f）。

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图2.单细胞RNA-seq和玉米根尖细胞类型聚类注释。（a）玉米根尖scRNA-seq和细胞类型聚类注释流程图概览。分别在Fv接种或模拟侵染后48小时从玉米Qi319和B104幼苗的5mm根尖分离原生质体。使用10×Genomics平台生成scRNA-seq文库，然后进行高通量测序。（b）利用t-SNE对玉米根尖的21个细胞簇进行可视化。每个点代表一个细胞。颜色代表不同的细胞簇。（c）利用原位杂交验证的26个细胞簇特异性标记基因的表达模式。点直径代表特定基因在一个特定细胞簇中的表达比例，颜色代表它们在这些细胞簇中的相对表达水平。（d）21个细胞簇中38个具有代表性的细胞簇特异性标记基因的表达模式。（e-f）RNA原位杂交验证了Qi319和B104根中分别推测的RAM（根尖分生组织）和RC（根冠）区域（e）以及表皮、皮层、内皮、中柱和木质部（f）的代表性细胞类型特异性标记基因。（e）和（f）中的比例尺分别为200μm和150μm。（g）利用t-SNE对玉米根尖中的七大种群及其空间分布进行可视化分析。

3 玉米根系中RAM和RC的分化轨迹

研究者****利用scRNA-seq技术可以探索植物细胞的发育状态和连续分化轨迹。单子叶植物和双子叶植物在植物地组织和根冠的分化上存在较大差异，即远端茎细胞产生根冠，QC侧的侧根冠细胞产生表皮，单子叶植物的地组织和表皮属于一个共同的初始，而双子叶植物的侧根冠和表皮共享一个共同的初始细胞。因此，研究者****尝试利用****拟时序****分析法，根据RAM和RC所代表的细胞群推断其分化轨迹。通过****拟时序****分析研究了RAM和RC细胞的分化轨迹，结果显示RC的分化晚于RAM（图3a,b）。这些结果支持了本研究中玉米根部scRNA-seq和细胞分类的准确性。

为了确定****调****控RAM和RC细胞之间分化转变的关键基因，****研究者****进行了分支表达分析建模，该方法使用惩罚性样条来推断单个基因的分支时间。RAM和RC之间的分化轨迹有三个分支点，分别标记为1、2和3（图3c-e）。研究者****调查了每个分支点的前100个显著变化基因，并展示了其代表基因。对于每个分支点，这些基因都分为四个基因簇，其基因表达模式各不相同，表现出根发育过程中的转录重排（图3c-e）。在RAM和RC的分化过程中，24和43个组蛋白家族成员在分支点1和3发生了显著变化，而在分支点2则没有发现任何变化（图3c，e）。编码谷胱甘肽转移酶的8个基因和11个基因分别只在分支点1和2被观察到（图3c、d），这表明它们在RAM和RC细胞分化中起着关键作用。这些发现深入揭示了根细胞发育的动态分化以及玉米根细胞状态转变过程中关键基因表达的重新布线。

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图3.玉米根尖分生组织和根冠的分化轨迹。（a）根尖分生组织（RAM）和根冠（RC）的彩色拟时轨迹。b）RAM和RC拟时轨迹上的细胞分布。（c-e）热图显示RAM和RC分化轨迹上三个分支点中显著变化的前100个基因

4 Fv应答基因在玉米基因型和根细胞类型中存在差异

为了确定Fv反应基因，****研究者****对两种基因型（Qi319和B104）中Fv处理和模拟条件下的七个细胞群进行了差异表达分析。在两种基因型的根细胞中，共有4049个基因有显著表达。在除茎外的七种细胞类型中，Fv诱导的DEGs总数在Qi319中高于在B104中。经Fv侵染后，在Qi319的所有七种细胞类型中，上调DEGs的数量（254-578）始终低于下调DEGs的数量（346-972）。相比之下，在所有七种细胞类型中，B104在Fv侵袭下招募了更多的上调DEGs（图S4a）。

在B104和Qi319的至少两种细胞类型中，67.69%-93.67%的Fv响应基因是重叠的（图S4b,c），这表明不同类型的根细胞可以招募相同的基因来响应Fv感染。其中，包括玉米抗虫性3（MIR3）、苯并恶嗪酮合成11（BX11）、萎缩1（Sh1）、枯草蛋白-糜蛋白酶抑制剂同源物1（SCI1）、Zm00001d034382和Zm00001d031677在内的6个保守基因在Qi319和B104的所有7种细胞类型中受Fv感染时均有差异表达（图S4d）。值得注意的是，在易感株系B104的所有七种细胞类型中，这六个DEGs在Fv感染时均上调，但在抗性株系Qi319中几乎被抑制（图S4e）。在同一细胞类型中，大多数对Fv反应的DEGs都是B104或Qi319的特异性DEGs，在Qi319和B104中，特异性DEGs的比例分别为67.5%-91.80%和57.91%-78.42%（图S4f）。

Fv感染后，大多数标记基因在两种基因型的相应细胞类型中都出现了显著的表达变化（图S5a,b）。例如，bZIP17在两种基因型的皮层细胞中均上调。CCP5在B104的偏木质部细胞中表现出显著的表达差异。在Qi319的RAM细胞中，H4C7.2和his2b1被高度激活，但在B104中却被抑制。值得注意的是，****研究者****还发现32个已知的植物病害相关基因在B104和Qi319株系中有显著的差异表达（图S5c，表S5）。这些基因中的大多数在Qi319的所有七种细胞类型中都在Fv感染后出现了显著的差异表达，而在B104中只有少数基因出现了差异表达（图S5c）。其中，ZmPAL1在B104的所有七种细胞类型中都受到Fv感染后的高度诱导，但在Qi319除木质部外的七种细胞类型中都受到显著抑制。ZmCAT1、ZmLOX3和ZmLOX4在Qi319的几乎七种细胞类型中都出现了下调。特别是，这4个基因在七种细胞类型中对Fv入侵的响应差异表达谱与批量RNA-seq（图S5c）和实时RT-PCR验证（图S6b,c）的结果基本一致。

为了确定Fv响应的DEG是否参与了疾病相关通路，****研究者****进行了GO和KEGG分析。在所有七种细胞类型中，60%-77.42%的GO项与苯丙酮、木质素和类黄酮生物合成过程、对真菌的防御反应和致病机理等生物过程有关（图S5d，表S6），这些过程参与保护根系免受病原体侵害。KEGG分析还显示，Fv诱导的DEGs显著富集于苯丙氨酸、苯丙氨酸和类黄酮生物合成途径以及植物与病原体的相互作用中（图S5e）。总之，这些发现表明，玉米根系的主要细胞类型在通过多种疾病相关途径应对Fv入侵方面发挥着重要作用。

5 7种根细胞类型中与关键基因调控因子的共表达调控模块

为了定义共表达基因簇，****研究者****使用WGCNA软件包对所有七种细胞类型中的4049个DEGs进行了基因共表达网络分析。结果显示，共表达网络由15个包含67至1297个基因的模块（M1至M15）和一个未指定的模块（M16）组成（图4a，表S7）。有14个模块（M1-7和M9-15）与B104和Qi319的七种细胞类型在Fv入侵和模拟后有显著相关性，r值在0.41至0.85之间。其中，8个（M1-4、6、7、12和15）和12个（M1、2、4-7和9-14）（图4b）模块分别与模拟和Fv处理显著相关（表S7）。这些重要的模块大多是一种细胞类型所特有的。例如，在模拟条件下，M3和M15分别与B104根的内皮细胞和Qi319根的皮层细胞特异相关。当Fv入侵时，M11、M13和M14模块分别与Qi319根的木质部细胞、表皮细胞和皮层细胞特异性相关。七个模块（M1、2、4、6、7、9和12）与代表不同细胞类型、基因型或处理的两个或三个样本显著相关（表S7）。

研究者还发现，图2c,d中显示的大多数标记基因都通过WGCNA被聚类到了相应的细胞类型中（图4b）。特别是在代表RAM的M6模块中发现了五个组蛋白基因H4C7、H4C7.2、H4C7.3、his2b1和his2B4。在这一模块中，有48个DEGs是组蛋白基因，占所有DEGs的58.54%，凸显了组蛋白家族在RAM发育过程中的作用（表S7）。这一发现表明，共表达网络分析可用于根据标记基因在某些细胞类型中的表达模式对细胞类型进行分类。

在Fv响应模块中，发现了41个标记基因和19个已报道的抗性基因（表S7）。此外，通过整合已发表的与玉米镰刀菌穗腐病（FER）和其他24种病害（病原体）相关的QTL和QTN，****研究者****发现在4049个Fv诱导的DEGs、先前发表的85个QTL簇和358个QTN簇（图S5f，表S8）中，195个重叠基因中有86个基因参与了Fv响应共表达模块。两个抗性基因（ZmCHTA1和ZmHCT2）和12个QTL/QTN预测基因在玉米根细胞分化和发育的不同分支点有显著差异表达（图3e-j，表S6）。因此，这些基因可能是单细胞分辨率下响应Fv感染的关键遗传因素。

阐明基因调控网络（GRN）对于了解植物保护机制以应对病害感染至关重要。研究者****利用机器学习方法GENIE3预测了148个关键调控因子的靶基因，包括19个已报道的抗性基因（ABP1也是一个标记基因）、86个QTL/QTN预测基因、41个标记基因（包括ABP1）、ZmWOX5b、ZmPIN1a和ZmYUC6在每个重要的Fv响应模块中的作用（表S9）。特别是在M11和M12中观察到了许多调控基因及其复杂的GRN，它们都对应于木质部细胞（表S9）。研究者****在图4b中使用Cytoscape展示了它们的GRN。

特别是uaz248a（his3），一个QTL/QTN预测的Fv响应基因（表S7），可能与RAM细胞模块M6中的3个标记基因（H4C7、his2b1和H4C7.2）、ZmPIN1a和ZmWOX5b相互作用（图4b，表S9）。之前的一项研究表明，WOX11（ZmWOX5b的同源物）在水稻芽发育过程中招募组蛋白H3K27me3去甲基化酶促进基因表达。PIN基因（至少是PIN1）的时空表达受到H3K27甲基化和去甲基化的微调，两者相互协调以确保侧根器官的正常发生。这些结果表明，GRN分析对于鉴定潜在的抗病基因及其调控网络具有重要意义。

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图4.Fv感染后七种根细胞类型中关键基因调控因子的共表达调控模块。（a）Fv感染和模拟接种后，与B104和Qi319根尖各细胞类型相关的16个共表达模块。括号中的数字表示每个模块中基因的数量。红色和蓝色分别代表高相关系数值和低相关系数值（Pearson）。M16表示未分配的模块。MK，模拟；RAM，根尖分生组织；RC，根冠。（b）12个基因调控模块，其中包含GENIE3对Fv感染做出响应的关键基因调控因子。每个节点代表一个基因，表现出调控关系的基因用边连接。红色代表Fv响应调控模块和关键调控因子，其他颜色代表受这些关键调控因子调控的预测靶基因。有注释的靶基因用Cytoscape显示（表S9）。表S7中五个调控基因（ZmFNS1、ZmAPX2、INCW1、TUB6和Zm00001d048667）的预测靶基因未找到。表S9中WAT1、Zm00001d032517、Zm00001d016664、Zm00001d048908和Zm00001d001862的基因调控网络未显示。

6 ZmWOX5b和ZmPIN1a通过调控IAA信号通路抑制玉米RAM中Fv的入侵

植物茎干细胞及其顶端分生组织中不断分化的子细胞有望保护细胞的完整性，防止生物入侵。本研究观察到的RAM不受Fv感染的特征促使****研究者****探索其潜在的分子机制。研究发现，在Fv入侵时，ZmWOX5b和ZmPIN1a在RAM细胞中上调，因此推测它们是Fv响应调控模块M6的关键基因（图4b，图S6a）。为了检验ZmWOX5b和ZmPIN1a是否参与了玉米RAM中宿主抵御Fv入侵的过程，研究人员通过融合原生基因和35S启动子（图S7a,b）并将其分别转化到近交系B104中，产生了增强ZmWOX5b和ZmPIN1a表达的转基因玉米植株（图S7a,b）。获得了同源品系WE8-6和WE12-2（增强ZmWOX5b的表达）以及PE6-2和PE10-4（增强ZmPIN1a的表达），并繁殖到T4代（图S7c,d），用于后续分析。这四个过表达株系（显示为WE+和PE+）的ZmWOX5b和ZmPIN1a表达量比非转基因同胞（WE^-和PE^-）高出26至33倍（图S7e,f）。这一结果得到了RNA原位杂交和GFP观察的证实（图5a,b）。此外，利用RNA干扰（RNAi）介导的ZmWOX5b和ZmPIN1a沉默也获得了转基因玉米（WR****⁺****和PR****⁺****）（图S7g,h），其中四个代表性的同源系WR2-6、WR3-4、PR6-1和PR7-4（图S7i,j）显示ZmWOX5b和ZmPIN1a的表达显著降低（图S7k,l）。

真菌感染后，ZmWOX5b和ZmPIN1a的增强表达株比非转基因株生根更深，主根和精根更长（图5c,d1,d3）。相反，与转基因阴性同系相比，四个RNAi株系的主根和须根生长明显受阻（图5c,d2,d4）。同时，过表达ZmWOX5b和ZmPIN1a能显著延缓Fv入侵时主根根腐病症状的发展。在Fv感染48 hpi时，4个过表达株系的幼苗根系普遍表现出轻微的腐烂症状，如浅褐色病斑，而非转基因株系的幼苗根系则表现出严重的腐烂症状，如深褐色病斑和根系萎缩。相比之下，RNAi阳性转基因植株的腐烂症状比转基因阴性植株更为严重（图5c）。因此，四株过表达的转基因幼苗的DSI值大大低于其非转基因兄弟姐妹，而四株RNAi株系的DSI值则明显高于其转基因阴性兄弟姐妹（图5e1、e2）。因此，ZmWOX5b和ZmPIN1a的过表达分别导致在真菌接种后玉米抗病相关标记基因的显著诱导（图S8）。

此外，****研究者****使用WGA染色法研究了Fv在玉米根中的定殖情况，发现在24 hpi时，过表达转基因根的上部维管束组织中仅可见少量Fv菌丝，但在RNAi转基因品系中，大量Fv菌丝几乎定殖于整个维管束组织，并扩散至RAM的边缘区（图5f）。单位面积的DTH和IOD测量进一步证实了这些观察结果（图5g）。这些结果表明，ZmWOX5b和ZmPIN1a参与了玉米RAM的先天性抗真菌侵染。

为了探索ZmWOX5b和ZmPIN1a保护玉米根免受Fv侵染的潜在机制，****研究者****采集了玉米根尖的不同区域，包括RC、RAM、过渡区（TZ）、EZ和成熟区（MZ），然后测定了它们的3-吲哚乙酸（IAA）含量。结果表明，与对照组相比，ZmWOX5b和ZmPIN1a过表达株系根尖五个区域的IAA含量都明显较高（图5h1、h3），而RNAi阳性株系根尖的IAA含量则明显较低（图5h2、h4）。值得注意的是，根据不同区域的IAA含量观察到根尖的IAA浓度梯度（图5h,i）。此外，之前的一些研究报道WOX基因参与了芽和根干细胞维持过程中的辅助素信号传导。为了检测ZmWOX5b是否影响了辅助素的生物合成，****研究者****利用ZmWOX5b过度表达株的主根尖15mm区域测定了五个与IAA生物合成相关的ZmYUC基因（ZmYUC2、4、5、6和9）的转录水平。其中，ZmYUC2和ZmYUC6的表达受到根尖段ZmWOX5b表达增强的显著刺激（图5j）。这些结果综合表明，ZmWOX5b和ZmPIN1a可通过调节IAA的生物合成抑制Fv在RAM中的感染，从而形成IAA浓度梯度，保护RAM不受Fv感染，促进玉米根的伸长。

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图5.ZmWOX5b和ZmPIN1a通过调节IAA信号抑制Fv入侵玉米RAM。（a）通过RNA原位杂交，观察表达增强的转基因事件（WE⁺8-6和PE⁺6-2）及其非转基因事件根尖RAM中ZmWOX5b和ZmPIN1a的转录水平。标尺=205μm。（b）用ZmWOX5b::GFP和ZmPIN1a::GFP融合构建体转化的转基因幼苗根系的GFP荧光显示了它们在RAM中的表达。比例尺=500μm。（c）Fv感染ZmWOX5b-和ZmPIN1a转基因幼苗根系（WE⁺和PE⁺表示表达增强；WR⁺和PR⁺表示RNAi）48 hpi时的腐烂症状。虚线框内的图像是红色箭头所指病根区域的放大图。比例尺=4cm。（d）48 hpi时ZmWOX5b-和ZmPIN1a-增强表达（d1和d3）及RNAi（d2和d4）转基因玉米幼苗主根和精根的长度比较。（e）在48 hpi时对ZmWOX5b-（e1）和ZmPIN1a-（e2）转基因幼苗根的DSI进行评估和比较，与WR⁺和PR⁺植株以及转基因阴性植株（WE^-、PE^-、WR^-和PR^-）相比，WE⁺和PE⁺植株的DSI明显降低。（f）在24 hpi时通过WGA-AF488染色监测Fv真菌在转基因幼苗根尖的定植情况。比例尺=500μm。（g）如（f）所示，通过测量根尖与菌丝（DTH）前进前线（g1）之间的距离，测量ZmWOX5b-和ZmPIN1a转基因幼苗根中Fv菌丝前进的距离。通过计算绿色荧光的面积密度（即IOD）来评估纵向切片的WGA信号，以揭示根尖内Fv的增殖过程（g2）。（h）ZmWOX5b和ZmPIN1a的表达增强提高了玉米根尖的IAA含量和辅助素浓度梯度。对根尖的不同区段（包括RC、RAM、TZ（过渡区）、EZ（伸长区）和MZ（成熟区））进行取样，并通过GC-MS测定ZmWOX5b高表达（h1）和-RNAi（h2）品系以及ZmPIN1a低表达（h3）和-RNAi（h4）品系的IAA含量。（i）漫画提供了玉米根尖的示意图，显示了不同区段和IAA浓度梯度。（j）从ZmWOX5b增强表达幼苗根尖5-10mm区域（ZmYUC2）（j1）和0-5mm部分（ZmYUC6）（j2）收集的与辅助素生物合成途径相关的YUC基因的转录水平。（d）、（e）、（g）、（h）和（j）中的值为平均SD值。P＜0.05，P＜0.01，****P＜0.001（根据配对学生t检验）。

7 苯丙类途径相关基因参与了多种根细胞的Fv防御

接种后，根细胞尤其是皮层、****中柱****和维管细胞中苯丙氨酸相关基因的差异表达（图S5c和S6）促使****研究者****探索这些基因是否参与协调宿主防御以应对微生物侵袭。其中，ZmPAL6（在M4中）、ZmCOMT（在M12中）和ZmCCoAOMT2（在M13中）在Fv入侵时出现在不同的GRN中（图4b），****研究者****选择了这些基因进行病毒诱导基因沉默（VIGS），以检测它们在抗真菌入侵中的潜在作用（表S10）。沉默效率测定结果表明，与对照植株相比，ZmPAL6、ZmCOMT和ZmCCoAOMT2的转录水平降低了80%-85%（图6a-c）。在ZmCCoAOMT2-沉默植株中，与ZmCCoAOMT2有83%相同度的ZmCCoAOMT1的表达未受影响（图6b2）。同样，在ZmPAL6沉默植株中，ZmPAL1、3和5的表达也未受到影响（图6a2-a4）。因此，这三个基因的基因沉默系已经成功实现，可以进行后续分析。

7****dpi时，BMV-GFP和嵌合BMVCP5预接种的玉米Va35植株分别受到Fv侵染的挑战。通过测量这些植株的腐烂症状和DSI，****研究者****发现沉默ZmPAL6、ZmCOMT和ZmCCoAOMT2会促进Fv在沉默植株根部的侵染，并导致比对照根部更严重的腐烂症状（图6d）。此外，DSI与腐烂症状的发展相一致，即通过VIGS在玉米植株根系中沉默这三个基因会导致DSI比对照根系增加约25%-35%（图6e）。此外，越来越多的证据表明，细胞壁受到病原体侵袭后，提供木质素形成单木质素的苯丙酮途径会被大大触发。

因此，****研究者****研究了Fv感染是否会增加木质素的生物合成，结果发现，当受到Fv感染时，ZmPAL6-、ZmCOMT1-和ZmCCoAOMT2-沉默的玉米植物根积累的木质素少于对照根（图6f）。为了进一步探究这些植物根中木质素沉积的分布情况，从紧邻病害的下部根段制备了横向超薄切片，这些切片没有明显的腐烂症状，并用于Ma¨ule染色。在对照根的下胚层细胞中观察到细胞壁木质化或增厚，而在沉默根中没有观察到。此外，对照根的外胚层和维管柱中沉积了大量木质素，而在沉默根的维管组织中观察到的木质素染色较弱（图6g）。这些结果表明，参与木质素生物合成的酚类物质可能会减缓或抑制Fv的繁殖。

许多PALs已被证明具有广谱抗菌活性，也有助于宿主防御微生物感染。为了研究ZmPAL6是否会调节宿主对多种病原体的反应，****研究者****考察了其对*****F.proliferatum*****（Fp）和*****Pythium******aristosporum*****（Pa）感染的沉默效应，这两种病原体也是玉米茎腐病的主要病原菌。通过测量DSI，沉默ZmPAL6能显著促进Fp和Pa在玉米根部的侵染（图6h）。此外，PAL是水杨酸（SA）生物合成途径中的关键酶。研究者发现，Fv感染会增加SA的含量，但在ZmPAL6被沉默的植物根系中，SA的积累并没有BMV-GFP感染植物根系中的严重增加（图6i）。同样，敲除ZmPAL6会影响SA响应基因ZmPR3、4、5和10的表达（图6j）。因此，SA可通过PAL依赖性途径合成，Fv诱导的SA积累可能是由于激活了苯丙氨酸途径。

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图6.苯丙酮途径相关基因参与几种根细胞的Fv防御。（a-e）通过BMV（锦毛花叶病毒）药物VIGS（病毒诱导的基因沉默）抑制玉米植株中苯丙氨酸途径相关基因的表达可促进Fv感染。分别在7 dpi和14 dpi测量了Fv感染叶片和根中ZmPAL6（a1至a4）、ZmCCoAOMT2（b1、b2）和ZmCOMT（c）的沉默效率和特异性。在7 dpi时，BMV-GFP和嵌合BMV-CP5接种的Va35株苗受到Fv的侵染。Va35幼苗接受Fv挑战，在48 hpi时记录接种幼苗根部病害区域的症状（d），以及Fv接种玉米幼苗根部的茎腐病DSI（e）。（d）中的比例尺=4cm。（f）瞬时沉默ZmPAL6、ZmCOMT和ZmCCoAOMT2会影响Fv感染玉米植株的木质素积累。（g）Fv感染后，木质素在ZmPAL6、ZmCOMT和ZmCCoAOMT2被沉默的幼苗根中的组织化学定位。从紧邻病害的下部根部切片制备横向超薄切片，然后进行Ma¨ule染色。表皮层和维管柱细胞中的紫红色染色表明存在S单元木质素。表皮下的最外层细胞被染成棕色，表明存在G单位木质素（箭头）。比例尺=100μm。（h）48 hpi时接种茎腐真菌病原体Fusariumproliferatum（Fp）和Pythiumaristosporum（Pa）的ZmPAL6沉默玉米幼苗根的茎腐DSI。（i-j）敲除ZmPAL6可减少水杨酸（SA）的积累并修复SA调控基因的表达。在48 hpi时从ZmPAL6沉默和Fv感染的玉米植株以及BMV-GFP预接种和Fvin感染的植株上收获样本，并进一步用于测量SA含量（i）和检测致病相关（PR）基因的表达（j）。除（d和g）外，（a-j）中的数值均为平均值（SD）。****P＜0.001（根据配对学生t检验），NS表示不显著。列上不同字母表示差异显著（P*＜0.05）（e和f），由Tukey-Kramer检验确定。

8 玉米根系细胞类型特异性免疫调控网络的构建

图4显示了Fv感染在不同根细胞类型中诱导基因共表达模块的程度，考虑到根细胞类型在生物胁迫响应中的不同功能，基于细胞类型特异性免疫模块的整合免疫调节网络对于深入理解玉米根系防御真菌入侵的分子机制至关重要。在GRNs中出现的基因中，****研究者****选择了16个已知的疾病相关基因和42个与FER（主要由Fv引起）相关的QTL/QTN预测基因（图4b，表S10）构建了整合免疫调节网络，其中根细胞类型和特定基因共表达模块用不同颜色标示（图7a）。综合调控网络由四个主要元素组成，即已知和预测的疾病相关基因及其在七种根细胞类型中表达丰度前三位的细胞类型、抗病信号或代谢通路，以及机器学习方法GENIE3预测的调控连接（图7b-g；表S10）。

RC和表皮作为面向外部环境的细胞层，在保护根系免受病原体侵袭方面起着重要作用。对于包括M1、M2和M13在内的三个RC或表皮特异性基因共表达模块（图4b），苯丙酮途径相关基因（如ZmCCoAOMT1/2和ZmHCT1/2）通过连接玉米根系RC和表皮细胞中的其他基因，成为波及这一免疫网络的关键组成部分。该网络中的这些基因与防御激素（如SA、JA、ET、CK和ABA）信号传导、ROS生成和清除、超敏反应（HR）、PCD、次生代谢物（如木质素、植物黄酮、黄酮类化合物和细胞壁）的生物合成、发育过程等有关（图7b）。

皮层也是根的外层，位于表皮之下、维管束之外，参与根对真菌感染的免疫反应。在M14模块（图4b）中，通过莽草酸途径生物合成黄酮类化合物可能是连接转录因子（TFs，如MBY42和bHLH103）以激活这一皮层特异性免疫网络的关键因素，该网络中的基因丰富且与ROS代谢、防御性代谢产物（木质素和香豆素）生物合成以及防御性激素（如JA和SA）信号传导有关（图7c）。此外，M9模块（图4b）代表两种细胞类型，其相关基因通过激素（如JA和SA）信号、ROS暴发和PCD参与诱导ETI（效应触发免疫）和下游防御反应（图7d）。中柱特异性M7模块（图4b）中的基因与防御激素信号、脂质代谢和糖转运有关（图7e）。

RAM特异性M6模块与中木质部特异性M11和M12模块之间的相互作用在基因表达水平上提供了新的调控机制，以支持IAA和SA相关防御途径之间的串扰（图5和7f）。SA是一种植物防御激素，在病原体相关分子模式（PAMP）触发的免疫（PTI）、ETI和系统获得性抗性（SAR）中起着关键作用，异构体合成酶（ICS）途径负责植物体内SA的基础积累和病原体诱导的积累。对于M4和M5（图4b）联合免疫网络，ICS-SA生物合成相关基因似乎是该网络中的关键因素，富集的基因与SA信号传导、ROS产生和清除、HR、细胞发育、防御性代谢产物沉积和PTI发射有关（图7g）。

总之，由已知和预测的疾病相关基因、其在根尖中的细胞类型、抗病信号或代谢途径以及调控连接组成的这六个综合调控网络，以单细胞分辨率深入揭示了玉米根尖主要细胞类型的免疫反应机制。

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图7.在玉米根中构建细胞类型特异性免疫调节网络。（a）玉米主根尖端横切面和纵切面示意图。不同颜色的矩形和圆形分别表示特定的细胞类型和基因共表达模块。根据研究者的调控分析，与Fv侵袭相关的已知抗性基因和QTL/QTN预测基因可归入细胞特性或细胞类型特异性免疫调节网络。（b）通过整合M1（RC_Qi319_MK/Fv）、M2（RC_B104_MK/Fv）和M13（Epidermis_Qi319_Fv）模块形成的苯丙酮途径相关免疫调节网络。（c）基于M14（Cortex_Qi319_Fv）模块的皮层特异性类黄酮通路相关免疫网络。（d）基于M9模块（Cortex/Metaxylem_B104_Fv）的皮层/木质部两种细胞类型的免疫网络。（e）基于M7模块（Stele_B104_MK/Fv-Qi319_Fv）的中柱特异性免疫网络。（f）基于RAM特异性M6（RAM_B104_MK/Fv-Qi319_Fv）、木质部特异性M11（Metaxylem_Qi319_Fv）和M12（Metaxylem_B104_MK/Fv）模块的IAA介导的抗病性与SA相关防御途径之间的串扰。（g）M4（Endodermis_B104_MK/Qi319_Fv）和M5（RC_Qi319_Fv）模块的相互作用。已知的玉米抗性基因、与Fv和其他病原体抗性相关的QTL/QTN预测基因（下划线）、七种主要细胞类型中表达丰度前三位的细胞类型以及特定的共表达模块用不同颜色表示。显示了已知抗性基因的通路或生物学功能，QTL/QTN预测基因的可能通路或生物学功能用下划线标出。括号中列出了与已知抗性基因相关的疾病或病原体。双向箭头表示已知的相互作用，双向虚线箭头表示GENIE3预测的相互作用。图中缩写的详细内容见附录S2。

讨论

1 一个全面的玉米根尖单细胞图谱为构建玉米根细胞类型特异性调控网络提供了可行性

在未来全球变暖的预测下，土传病原体引起的植物病害预计将在全球范围内流行。要制定新的病害控制策略，就必须更好地了解植物根系的遗传抗病潜力和免疫反应的调控机制。本研究****报告了两个近交系中玉米根尖的综合单细胞图谱，并利用****研究者****定义的细胞标记、RNA原位杂交和之前报告的相关信息，鉴定了21个细胞簇和7种主要细胞类型。本研究观察到的细胞群数量和细胞类型与已发表的玉米根部scRNA-seq研究基本一致。在研究者定义的细胞标记中，包括24个制造者在内的856个标记基因（如Zm00001d049683、Zm00001d017508、Zm00001d003707、α-碳酸酐酶7）经RNA原位杂交验证后显示出与先前报告相同的细胞类型（图2f、图S3、表S3、S11）。值得注意的是，这里报告的68个标记基因（如异常花粉传递1、NAC131、CCP5、植物硫激肽前体1）的细胞类型与已发表的两项研究（表S3）完全一致。耐人寻味的是，根据标记基因Zm00001d051333的RNA原位杂交，研究者还发现第14簇是髓（一种亚茎细胞类型）（图S3g,h）。因此，第14簇的标记基因将来可用于鉴定根髓细胞。与之前的研究相比，本研究通过RNA原位杂交验证了根尖的细胞类型，因此这些已鉴定的细胞类型特异性标记基因可用于细胞分选，以产生高质量的细胞类型特异性玉米根尖转录组。

借助WGCNA和GENIE3，一个全面的玉米根尖单细胞图谱为剖析玉米根细胞特异性调控网络提供了可行性。如前所述，通过对玉米抗病相关文献的文献计量学和综合生物信息学分析，创造性地筛选出了QTL和QTN预测的玉米病害相关基因和已知的抗病相关基因。将这些基因与来自scRNA-seq数据的4049个Fv响应DEGs进行比较，发现Fv诱导的共表达模块中存在148个与特定细胞类型重叠的基因（图4b；图S5f）。其中，研究者发现RAM特异性ZmWOX5b和ZmPIN1a基因通过协调根尖中IAA的不均匀分布，保护RAM免受Fv感染（图5h,i）。此外，ZmPAL6、ZmCOMT和ZmCCoAOMT2通过调节真菌侵袭时根细胞壁中木质素的沉积，参与对Fv的防御反应（图6）。值得注意的是，这三个基因在不同的细胞类型中起作用。ZmCOMT的基因敲除表达会导致木质素含量和下胚层细胞、维管束中柱体和内胚层三到四个细胞层的木质素染色急剧下降（图6g），这些区域（不包括最外层的下胚层细胞）的木质素被丁香基（S）单位木质化。ZmCCoAOMT2与ZmCOMT类似，在单木质素生物合成中起下游作用，似乎对最外层下表皮细胞的组成木质化更为重要（图6g），这些细胞沉积了木质素聚合物的愈创木基（G）单元。同样，在ZmPAL6被沉默的根的所有木质化细胞类型（下胚层细胞、维管束中柱体和内胚层）中，木质素的组织化学染色水平都很低（图6g），这表明ZmPAL6参与了木质素生物合成的上游调节途径。这些结果证明，苯丙酮途径相关基因可通过其细胞特异性调控网络调控不同类型细胞的木质素沉积（图4b和7b、f）。

2 免疫网络揭示了真菌侵染后玉米根系的全球宿主反应的重叠

植物进化出了两种感官机制来识别病原体入侵。一种是位于细胞表面的模式识别受体（PRRs）感知称为PAMPs的保守微生物诱导物，从而启动PTI。第二类感知涉及细胞内受体直接或间接识别称为效应物的病原体毒力分子，这种识别启动ETI。一些细胞事件与PTI和ETI相关，包括快速激活有丝分裂原活化蛋白激酶（MAPKs）和钙依赖性蛋白激酶（CDPKs）信号、ROS迸发和清除、防御激素信号、防御相关代谢物（如木质素、植物黄酮素、香豆素、胼胝质等）的生物合成和沉积、基因表达的表观遗传调控以及局部细胞死亡。考虑到根的性能由不同根细胞的协同作用决定，****研究者****进行了细胞类型特异性转录组分析，以确定受Fv挑战的玉米根不同类型细胞中的调控网络（图4）。在此基础上，构建的免疫调节网络提供了PTI和ETI相关信号通路及下游免疫反应的全局场景（图7，表S10）。值得注意的是，在两个近交系中，Fv接种后植物防御相关生理生化特征的表型变化证实了这些免疫调节网络（图1i、k，图S1i）。此外，在这些免疫调节网络中，SA信号通路存在广泛的重叠（图7b、d-h），与之前发表的结果一致，证明了这些构建的免疫调节网络的可行性。

通过将WGCNA与GENIE3分析相结合，****研究者****以细胞类型特异性的方式在这些免疫调节网络中发现了不同的调控模式（图4b和图7），并发现它们能有效地阐明DEGs的调控网络。例如，TF基因MYB42是三个关键调控因子（MO2、ASN3和JRG21）的靶基因（图4b，表S9），它通过抑制木质素通路的基因参与细胞壁结构，通过GENIE3方法，它也被预测与木质素合成有关（图7c）。其他TF靶基因属于WRKY、bHLH和NAC家族，据报道它们是植物与病原体相互作用的重要因素，这些基因被发现与防御激素信号、ROS爆发和HR防御有关（图7b-d,g），这表明研究者的预测工具在揭示细胞类型特异性调控网络之间相互作用方面的准确性。

3 玉米根系细胞类型特异性免疫网络为剖析其抗病机制奠定了基础

本研究****的发现表明，根细胞类型在Fv感染下保持其特征，细胞类型标记基因的表达模式和Fv感染下细胞特征基因的调控（图4b和7；图S5a,b），****表明了细胞特征和细胞类型特异性免疫调节网络的相互作用。研究者****的实验数据（图5和图6）和构建的免疫调节网络（图7b-g）表明，通过感知器（受体）到激素的信号转导，根系发育和抗病网络之间存在密切的相互依存关系，从而调整根系的整体发育以应对真菌刺激。细胞特性和细胞类型特异性免疫网络的相互作用丰富了基因水平的调控机制，以支持植物发育-环境界面的这种串扰。这些发现表明了玉米根系免疫信号调节真菌入侵的复杂性。为构建细胞型特异性免疫网络而选择的基因与玉米的主要病害有关（表S10），因此这些防御途径很可能适用于通过使用基因编辑和基因过表达技术验证这些基因的功能，从而探索针对病原体的免疫应答和抗病机制，如之前在玉米中所述。

本研究****通过结合细胞特异性转录组和实验验证，构建了六种细胞特异性免疫调节网络，以应对Fv感染。****本****研究不仅提供了根系发育过程中玉米细胞命运决定的全局视图，还以单细胞分辨率深入了解了玉米根尖主要细胞类型的免疫调节网络，从而为剖析玉米抗病性的分子机制奠定了基础。