Q：该如何选择limma, DESeq2, edgeR
A：各有各自应用的场景
- 如果是芯片数据，一般选择limma，毕竟它是处理芯片数据之王。 不过edgeR也可以。芯片数据默认符合正态分布，而limma正是基于正态分布。
- 如果是二代测序的原始count值，一般选择DESeq或edgeR。注意这两者只能处理count，不能处理FPKM等矫正后的数据。二代测序数据符合柏松分布，理论上不能用T检验，只能用非参数检验（秩和），但是统计力度不够，所以还是得用经过矫正后的参数检验。
- 如果是FPKM等矫正后的表达量，可以用cuffdiff
Sum: 基于以上，对于二代测序数据，先拿到原始count值进行DESeq2差异分析，再转换成TPM进行下游分析。不建议用edgeR和cuffdiff。
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今天写的是limma进行差异分析。PS：limma的说明书实在太太太长了，不过却是入门生信必读的。
Step1: 准备数据
-
group数据
group分组信息 -
表达谱数据
Step2: 构建design 样本分组矩阵
library(limma)
design <- model.matrix(~0+group)
rownames(design) = colnames(expr1)
colnames(design) <- levels(group)
Step3: 构建进行差异分析的对象
%构建DGElist对象
DGElist <- DGEList(counts = expr1, group = group)
% 去除表达量过低的基因
% Compute counts per million (CPM)
keep_gene <- rowSums(cpm(DGElist) > 1) >= 2
table(keep_gene)
DGElist <- DGElist[keep_gene, ,keep.lib.sizes =FALSE]
Step4：构建线性模型
% 计算列的矫正因子
DGElist <- calcNormFactors( DGElist )
% 将count值转化成log2-counts per million (logCPM)，准备进行线性回归
v <- voom(DGElist, design, plot = TRUE, normalize = "quantile")
% 对每一个基因进行线性模型构建
fit <- lmFit(v, design)
% 构建比较矩阵
cont.matrix <- makeContrasts(contrasts = c('cancer-normal'), levels = design)
% 构建芯片数据的线性模型，计算估计的相关系数和标准差
fit2 <- contrasts.fit(fit, cont.matrix)
% 基于贝叶斯计算T值，F值和log-odds
fit2 <- eBayes(fit2)
Step5：得出结果
nrDEG_limma_voom = topTable(fit2, coef = 'cancer-normal', n = Inf)
nrDEG_limma_voom = na.omit(nrDEG_limma_voom)
head(nrDEG_limma_voom)
% 筛选出符合要求的差异基因
library(dplyr)
res<-cbind(rownames(nrDEG_limma_voom),nrDEG_limma_voom)
res_1<-res %>% dplyr::filter((logFC>1 | logFC < (-1)) & adj.P.Val < 0.05)
colnames(res_1)[1]<-"Symbol"
