安医大陈飞虎团队揭示METTL3介导m6A甲基化在炎症性疾病发病机制中的表观调控作用：IJBM

近日，安徽医科大学徐亚运、柳文强为共同第一作者，陈飞虎教授为唯一通讯作者，在《INT J BIOL MACROMOL》（简称IJBM)期刊发表题为“METTL3 increases ferroptosis resistance to facilitate the tumor-like features of rheumatoid arthritis synovial fibroblasts through enhancing SLC7A11 mRNA stability in an m6A-IGF2BP2-dependent manner”的科研成果。研究聚焦于类风湿关节炎（Rheumatoid Arthritis, RA）滑膜成纤维细胞（Synovial Fibroblasts, SFs）的肿瘤样特性（tumor-like characteristics），探讨了N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine, m6A）修饰在RA发病机制中的作用，特别是METTL3通过m6A修饰增强SLC7A11 mRNA稳定性，进而影响RA滑膜成纤维细胞的增殖、迁移和侵袭能力的分子机制。

标题：METTL3 increases ferroptosis resistance to facilitate the tumor-like features of rheumatoid arthritis synovial fibroblasts through enhancing SLC7A11 mRNA stability in an m6A-IGF2BP2-dependent manner（METTL3通过m6A-IGF2BP2依赖性方式增强SLC7A11 mRNA稳定性，提高铁死亡抗性，从而促进类风湿关节炎滑膜成纤维细胞的肿瘤样特性）

发表时间：2025年7月5日

发表期刊：INT J BIOLMACROMOL

影响因子：IF8.5/Q2

技术平台：MeRIP-seq、RNA-seq

DOI:10.1016/j.ijbiomac.2025.145698

激活的类风湿关节炎滑膜成纤维细胞（RASFs）表现出肿瘤样特性，在类风湿关节炎（RA）的关节破坏中起着重要作用。m6A作为mRNA上的重要修饰，参与多种生物过程，然而其在RA发病机制中的具体作用尚未完全明确。本研究旨在探讨m6A甲基化对RASFs增殖、迁移和侵袭的作用及其潜在机制。研究结果揭示RA患者滑膜和滑膜成纤维细胞中METTL3表达上调。敲低METTL3可减少RASFs增殖、迁移和侵袭。具体而言，METTL3介导SLC7A11 mRNA的m6A修饰，通过与胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白2（IGF2BP2）互作以增强其稳定性。此外，METTL3敲低加速RASFs中erastin诱导的铁死亡，并进一步抑制RASFs肿瘤样特性。通过在胶原诱导性关节炎（Collagen-Induced Arthritis, CIA）小鼠模型的关节内注射携带shMETTL3的慢病毒实验显示出关节炎严重程度减轻和抑制滑膜成纤维细胞侵袭行为。总之，本研究结果表明，METTL3介导的m6A修饰在RA滑膜增生和侵袭的发病机制中起着关键作用。靶向METTL3治疗干预可能为RA的治疗提供一种新方法。

示意图：METTL3介导的SLC7A11 m6A修饰参与RASFs增殖、迁移和侵袭

研究方法

患者和组织样本：研究纳入RA患者，以及因关节创伤接受手术的对照组患者。从患者中获取滑膜组织样本，分离出滑膜成纤维细胞（SFs）。

细胞转染：使用siRNA技术敲低METTL3、IGF2BP1、IGF2BP2、IGF2BP3等基因并进行转染。

m6A修饰检测：通过MeRIP-qPCR技术定量分析检测m6A修饰水平。

RNA测序（RNA-seq）和m6A测序（MeRIP-seq）：对METTL3敲低和对照组的RASFs进行RNA-seq和MeRIP-seq，分析m6A修饰的基因表达差异。

动物实验：在胶原诱导性关节炎（CIA）小鼠模型中，通过关节内注射携带METTL3 shRNA的腺相关病毒（AAV9）载体，评估METTL3敲低对关节炎严重程度的影响。

结果图形

（1）RA患者滑膜和滑膜成纤维细胞中m6A水平及m6A修饰相关蛋白的表达

在RA患者的滑膜组织中，m6A修饰水平显著高于对照组（图1A）。与关节创伤患者相比，RA患者的滑膜中METTL3蛋白水平显著升高（图1B-C）。在胶原诱导性关节炎（CIA）小鼠模型中，研究人员也观察到滑膜组织中METTL3蛋白水平的上调（图1D-E）。

为全面了解METTL3在RA中的作用，研究人员还比较了RA患者滑膜成纤维细胞（RASFs）和正常滑膜成纤维细胞（NSFs）中METTL3的表达水平。结果显示，无论是mRNA水平还是蛋白水平，METTL3在RASFs中的表达均显著高于NSFs（图1F-H）。此外，RA患者的滑膜中METTL3蛋白水平与红细胞沉降率（ESR）和C反应蛋白（CRP）水平呈正相关（图1I-J）。这些结果表明，METTL3在RA的发病机制中可能存在关键作用。

图1：RA患者滑膜和SFs中METTL3表达增加。 (A)    采用点杂交实验检测RA患者和关节创伤患者滑膜中m6A的水平。 (B-C) 通过免疫组化分析RA患者和健康对照者FLSs中m6A甲基化相关酶的表达。 (D-E) 通过免疫组化分析CIA小鼠和对照小鼠滑膜中METTL3的表达。 (F-H) 通过(F)RT-qPCR和(G和H)免疫荧光分析RASF和NSF中METTL3的表达。 (I)   分析RA患者滑膜中METTL3与ESR的相关性。 (J)  分析RA患者滑膜中METTL3与CRP的相关性。

（2）METTL3敲低抑制RASFs的增殖、迁移和侵袭

通过siRNA技术敲低METTL3后，RASFs的增殖能力显著降低，如CCK-8和EdU实验所示（图2A-C）。此外，METTL3敲低还抑制RASFs的迁移和侵袭能力，通过Transwell实验和创伤愈合实验进一步验证（图2D-H）。这些结果表明，METTL3在RASFs的肿瘤样特性中发挥重要作用。

图2：METTL3敲低抑制RASFs的增殖、迁移和侵袭。 （A-C）CCK-8和EdU实验结果，显示METTL3敲低对RASFs增殖的作用。 （D-F）Transwell实验结果，显示METTL3敲低对RASFs迁移和侵袭的作用。 （G-H）伤口愈合实验结果，显示METTL3敲低对RASFs迁移能力的作用。

（3）SLC7A11是METTL3在RASFs中的m6A修饰靶点

通过m6A测序（m6A-seq）和RNA测序（RNA-seq）技术，研究人员对METTL3敲低的RASFs进行了全面的多组学分析。分析结果揭示，METTL3敲低的RASFs中SLC7A11 mRNA的m6A修饰显著减少（图3B）。SLC7A11蛋白水平在METTL3敲低后也显著降低（图3C-D）。此外，通过双荧光素酶报告基因实验验证了METTL3对SLC7A11 mRNA的m6A修饰作用（图3E-F）。这些结果表明，METTL3通过m6A修饰调控SLC7A11 mRNA的稳定性。

附图3：m6A-seq（MeRIP-seq）和RNA-seq鉴定METTL3的下游靶点。 （A）差异表达基因的火山图。 （B）差异m6A修饰位点的火山图。 （C）m6A水平和mRNA表达水平显著变化的基因分布。

图3：METTL3介导SLC7A11 mRNA的m6A修饰，增强其表达。 (A)  通过RT-qPCR分析METTL3缺失的RASFs与siRNA-NC细胞相比NRG1、CKAP2L、SLC7A11、ZBTB2和GRPR的表达。 (B)  通过MeRIP-qPCR检测METTL3缺失的RASFs与siRNA-NC细胞相比NRG1、CKAP2L、SLC7A11、ZBTB2和GRPR的m6A修饰。 (C-D) METTL3敲低后RASFs中SLC7A11蛋白的表达。 (E-F) 通过双荧光素酶报告基因实验验证SLC7A11和METTL3的互作。 (G-I) 通过免疫组化评估RA患者和CIA小鼠滑膜中METTL3的表达。 (J)   通过RT-qPCR评估RASF和NSF中METTL3的mRNA表达。 (K-L) 通过免疫荧光评估RASF和NSF中METTL3的蛋白表达。

（4）METTL3敲低加速erastin诱导的铁死亡并进一步抑制RASFs的肿瘤样特性

在RASFs中，METTL3敲低加速了erastin诱导的铁死亡，表现为线粒体膜电位降低、GSH水平下降、MDA水平升高以及ROS水平增加（图4A-E）。此外，METTL3敲低进一步抑制erastin处理的RASFs肿瘤样特性，如增殖、迁移和侵袭能力的降低（图5A-H）。这些结果表明，METTL3通过调控铁死亡促进RASFs的肿瘤样特性。

图4：METTL3敲低加速RASFs中erastin诱导的铁死亡。 (A) 采用JC-1染色检测线粒体膜电位。 (B) 通过透射电子显微镜观察线粒体形态。 (C) 利用DCFH-DA探针检测细胞内ROS释放。 (D) 检测GSH水平。 (E) 检测MDA水平。

图5：METTL3敲低抑制经erastin处理的RASFs肿瘤样特性。 (A)  通过CCK-8实验监测RASFs的生长曲线。 (B-C) 利用EdU染色检测RASFs的增殖情况。 (D-F) 采用Transwell实验检测RASFs的趋化迁移和侵袭能力。 (G-H) 通过创伤愈合实验分析RASFs的迁移能力。

（5）鉴定出SLC7A11 mRNA上m6A修饰的reader蛋白IGF2BP2，其介导稳定性和表达增加

通过RNA免疫沉淀（RIP）实验，发现IGF2BP2能与SLC7A11 mRNA结合，并且这种结合依赖于m6A修饰（图6C-F）。IGF2BP2的过表达部分抵消了METTL3敲低对erastin诱导的铁死亡作用（图7E-H）。这些结果表明，IGF2BP2通过介导SLC7A11 mRNA上的m6A修饰，增强了其稳定性和表达。

图6：IGF2BP2识别SLC7A11 mRNA的m6A修饰并增强其稳定性和表达。 (A)  经ActD（5μg/ml）处理后，RT-qPCR在指定时间点检测有或没有METTL3缺失的RASFs中SLC7A11 mRNA衰变率。 (B)  通过RT-qPCR检测IGF2BPs敲低对SLC7A11 mRNA表达的影响。 (C)  RIP-qPCR结果显示了SLC7A11与RASFs中的IGF2BPs的关联。 (D)  经ActD（5μg/ml）处理后，RT-qPCR在指定时间点检测有或没有IGF2BP2缺失的RASFs中SLC7A11 mRNA衰变率。 (E)  在有或没有IGF2BP2敲低的RASFs中，检测WT和Mutpmir-GLO质粒的荧光素酶活性。 (F)  RIP分析揭示在DAA抑制SLC7A11的m6A甲基化后，SLC7A11与IGF2BP2的结合。

（6）SLC7A11或IGF2BP2过表达挽救了METTL3敲低促进的erastin诱导的铁死亡

SLC7A11或IGF2BP2过表达部分抵消了METTL3敲低对erastin诱导的铁死亡的影响，表现为线粒体膜电位和GSH水平的增加，以及MDA水平的降低（图7A-D）。这些结果进一步证实了SLC7A11和IGF2BP2在METTL3调控铁死亡中的重要作用。

图7：SLC7A11或IGF2BP2过表达挽救了由METTL3敲低促进的erastin诱导的铁死亡。

(A) SLC7A11过表达对线粒体膜电位的影响。

(B) SLC7A11过表达对线粒体形态的影响。

(C) SLC7A11过表达对GSH水平的影响。

(D) SLC7A11过表达对MDA水平的影响。

(E) IGF2BP2过表达对线粒体膜电位的影响。

(F) IGF2BP2过表达对线粒体形态的影响。

(G) IGF2BP2过表达对GSH水平的影响。

(H) IGF2BP2过表达对MDA水平的影响。

（7）局部敲低METTL3减轻RA模型中的关节炎严重程度

在CIA小鼠模型中，通过关节内注射携带METTL3 shRNA的AAV9载体，显著减轻了关节炎症状，包括关节肿胀、滑膜增生和软骨侵蚀（图8B-J）。这些结果表明，METTL3的局部敲低是一种潜在的RA治疗策略。

图8：关节内注射METTL3 shRNA对CIA大鼠关节炎严重程度的影响。

(A) CIA模型的诱导和干预示意图。

(B) sh-METTL3对CIA小鼠体重的影响。

(C) sh-METTL3对CIA小鼠多关节炎指数的影响。

(D) 关节的H&E染色、甲苯胺蓝染色(toluidine blue)、番红O-固绿染色以及SLC7A11和METTL3免疫组化代表性图像。

(E) 对滑膜炎症的组织形态学分析的定量分析。

(F) 对滑膜增生的组织形态学分析的定量分析。

(G) 对软骨侵蚀的组织形态学分析的定量分析。

(H) 对骨侵蚀的组织形态学分析的定量分析。

(I) 对滑膜中SLC7A11表达的免疫组化定量分析。

(J) 对滑膜中METTL3表达的免疫组化定量分析。

结论和启示

本研究通过m6A-seq和RNA-seq技术，揭示了METTL3通过m6A修饰调控SLC7A11

mRNA稳定性，进而影响RASFs的肿瘤样特性和铁死亡的分子机制。这些发现为RA的治疗提供了新的靶点，特别是通过靶向METTL3或其下游靶点SLC7A11和IGF2BP2，可能成为治疗RA的新策略。此外，本研究还强调了m6A修饰在自身免疫性疾病中的重要作用，为未来类似研究提供了新的思路和方法。

MeRIP-seq在本研究中的重要作用

本研究MeRIP-seq技术不仅帮助确定了SLC7A11 mRNA上的m6A修饰位点，还揭示了METTL3 SLC7A11 mRNA稳定性的调控机制。这一发现为理解RA的发病机制提供了新的视角，并为开发新的治疗策略提供了潜在的靶点。未来类似的研究可以利用MeRIP-seq技术深入探索m6A修饰在其他疾病中的作用，特别是在自身免疫性疾病和癌症中。

参考文献：

XuY, Liu W, Zai Z, Qian X, Hu W, Peng X, Chen F. METTL3 increases ferroptosis resistanceto facilitate the tumor-like features of rheumatoid arthritis synovialfibroblasts through enhancing SLC7A11 mRNA stability in anm6A-IGF2BP2-dependent manner. Int J Biol Macromol. 2025 Jul 5:145698. doi:10.1016/j.ijbiomac.2025.145698.