影响因子：11.7
研究概述：CD8+ T细胞在肿瘤中涵盖了从干性、记忆、效应到功能衰竭等的一系列功能状态，这些状态都是由CD8+ T细胞内在调控和肿瘤微环境（TME）共同塑造的。所以，利用肿瘤浸润的CD8+ T细胞（TILs）的效应阶段是许多癌症治疗方法的目标。其中，一个主要策略是阻断主要在功能障碍的CD8+ TILs上高表达的免疫检查点受体，目前主要是CTLA4和PD1。尽管免疫检查点阻断（ICB）在黑色素瘤、肺癌和肾癌等癌症中取得了成功，但只有12%的患者能够响应所有ICB。而TME是ICB响应的关键决定因素，但其如何影响T细胞功能仍不完全清楚。这主要是因为TME在不同的癌症类型之间和内部变化很大，具有不同程度的血管化、免疫浸润以及癌症相关成纤维细胞等非免疫细胞类型的存在。这些因素会影响影响T细胞的抗原呈递、免疫调节信号以及氧气和其他营养物质的供应。因此，更好地理解多种肿瘤类型和不同TME中的CD8+ T细胞状态，对于开发广泛有效的治疗方法至关重要。本篇研究在此，作者开发了一种能够跨细胞、患者和数据集识别的降维方法，并将其应用于来自132例肿瘤样本的单细胞RNA测序数据。作者发现了一种泛癌的T细胞功能障碍状态（包括免疫检查点CTLA4、PDCD1和HAVCR2，以及趋化因子受体CXCR6），其表达水平可以预测黑色素瘤队列中ICB治疗失败。进一步研究CXCR6的调控发现：它由AP-1诱导，并被TCF1抑制。CXCR6的敲降可促进PD1+TIM3+ CD8+ TILs的凋亡，降低了Tox、Bcl2和CD28的表达，最终削弱了肿瘤生长控制。具体结果如下：

研究结果：

GDMF: 一种通用矩阵分解框架，能够跨细胞、患者和数据集识别的降维方法

作者开发了一种通用矩阵分解框架（GMDF）用于大规模多样数据集的无监督分析。给定一组单细胞数据，GMDF通过将细胞特征分解为“共享”和“特定场景”的基因，识别跨条件的细胞状态。GMDF可以在降维任务的制定和实施中结合协变量和“特定场景”。“场景”由用户根据具体的数据集和研究问题定义，可以表示特定的癌症类型、性别、治疗、队列等。GMDF根据数据集内的变异识别表达程序，如果这种数据集内的变异在多个数据集中反复观察到，那么它将被定义为“共享”。如果这种数据集内的变异仅在特定“上下文”的数据集中观察到，则它将被识别为“特定场景”。通过关注“共享”而不是“特定场景”特定的程序，可以识别即使在具有不同癌肿的研究中也会重复出现的生物学上有意义的变异（图A）。

为了绘制不同癌症类型中的CD8+ T细胞状态图谱，作者汇总了来自九个数据集的泛癌scRNA-seq数据（来自132名黑色素瘤、肉瘤、胰腺癌、肝癌、结肠癌、肺癌和乳腺癌患者的33,161个CD8+ TILs）。作者将GMDF应用于这个泛癌CD8+ T细胞数据中，识别每个队列中反复观察到的“共享”基因模块。作者将GMDF识别出的六个模块注释为初始/记忆、激活/干扰素反应、AP1/应激反应、细胞周期、线粒体代谢和慢性激活（图B）。为了进一步研究功能障碍和激活的关联性，作者基于其整体表达计算每个细胞的“激活评分”。随着细胞表现出更高的激活评分，它们与慢性激活的评分数值也越来越高，并表现出更多的细胞间变异（图1C-D，T细胞被注释为初始/记忆--低激活评分、效应--高激活以及功能障碍）。在这里，慢性激活评分是基于与T细胞功能障碍相关的基因，包括免疫检查点（HAVCR2、TIGIT、PDCD1、CTLA4、LAG3和ENTPD1）、效应基因（GZMB、IFNG和FASLG）以及转录因子TOX等72个基因。总的来说，慢性激活评分可以将细胞分为三种状态：效应，功能障碍和幼稚/记忆。

“慢性激活”基因集在预测免疫治疗疗效的应用

为了测试“慢性激活”基因集在泛癌的临床价值，作者评估了黑色素瘤患者ICB治疗前后CD8+ TILs的单细胞数据表达水平（图A）。与响应者相比，未响应患者的“慢性激活”表达更高（图A）。并且，“慢性激活”评分无论是在单细胞（ROC曲线下面积AUC = 0.72）还是样本（AUC = 0.86）水平上，都可以很好地预测黑色素瘤患者临床ICB的应答情况（图B）。具体而言，在四名具有ICB应答和ICB非应答病灶的患者中，“慢性激活”评分显示出ICB非应答病灶的细胞中显著更高的表达（图C）。

CXCR6是泛癌“慢性激活”中功能障碍高排名基因

作者在GMDF处理过程中发现，在“慢性激活”基因中，CXCR6排在前五位。同时CXCR6也是唯一一个在所有癌症中一致标记功能障碍T细胞的基因。既往文献报道：CXCR6与改善的免疫反应以及效应和记忆T细胞的募集和迁移有关。最近的研究表明，CXCR6在多种癌症类型和慢性病毒感染中的功能障碍T细胞中表达。此外，CXCR6介导的CD8+ T细胞与肿瘤内树突状细胞之间的相互作用在小鼠黑色素瘤模型中对于持续的肿瘤控制非常重要。鉴于这些研究表明CXCR6对抗肿瘤免疫的重要性，作者将在下面的研究深入研究CXCR6。作者发现，CXCR6主要在T细胞中表达，而其配体CXCL16主要在三种肿瘤类型（肉瘤、肺癌和黑色素瘤）和胶质母细胞瘤数据的髓样细胞表达（图A）。并且，在所有数据集中，CXCL16在巨噬细胞中与‘’抗原加工和呈递特征‘’共表达（图B）。这些发现，结合之前报道的小鼠模型数据显示，CD8+ T细胞CXCR6的表达与树突状细胞的CXCL16相互作用，CXCR6- CXCL16可能介导小鼠和人类肿瘤中T细胞的慢性活化。

接下来作者在B16/MC38动物模型发现CXCR6表达水平会随着CD8+T细胞的功能状态和肿瘤进展不断变化，终末期的CD8+T细胞中CXCR6表达水平最高（图C）。在CD8+ TILs中，表达CXCR6的细胞水平从PD1-TIM3-（初始细胞）到PD1+TIM3-（干细胞样PD1+TCF1+TIM3-和效应样PD1+TCF1-TIM3-）再到PD1+TIM3+（终末功能障碍）细胞逐渐增加（图C）。并且，CXCR6+ TILs表达更多与效应功能相关的CX3CR1、Ki-67以及多种共抑制受体（PD1、TIM3、LAG3、TIGIT和CD39）和Tox等相关（图D）。动物模型提示，CXCR6配体CXCL16在三个肿瘤模型中的髓样细胞中表达，MHCII高表达的巨噬细胞中表达最高，其次是MHCII低表达的巨噬细胞和DC亚群（图E）。最后，作者进一步在动物模型探究肿瘤进展过程中CXCR6的表达变化。作者比较了在肿瘤早期和晚期阶段B16Ova肿瘤中的CD8+ TILs。但随着肿瘤进展，PD1+TIM3-和PD1+TIM3+细胞中的CXCR6表达逐渐增加（图F）。因此，随着肿瘤进展，CD8+ T细胞在转变为效应状态并最终达到终末功能障碍T细胞状态时，逐渐获得了CXCR6的表达。

ICB可上调CXCR6, 并且受到TCF1抑制

上文提及，从效应到功能障碍CD8+ TILs的CXCR6表达梯度增加。为了在受控环境下进一步测试这一点，作者在两种不同的肿瘤模型（Mc38Ovahi和B16Ova）和两种不同的ICB疗法（抗PD1和抗PD-L1 + 抗TIM3）进行实验。在免疫原性强的Mc38Ovahi模型中，ICB治疗后PD1+TIM3-和PD1+TIM3+ CD8+ TIL群体中表达CXCR6的细胞比例增加（图A）。在免疫原性较弱的B16Ova模型中，ICB治疗后PD1+TIM3-亚群中表达CXCR6的细胞比例增加，但在PD1+TIM3+亚群中CXCR6表达差异不大（图B）。此外作者还发现，ICB治疗后PD1+TIM3-细胞中包含TCF1+干细胞样和TCF1-效应样细胞，有趣的是，在这个群体中，TCF1和CXCR6表达是互斥的。因此，这个群体中CXCR6表达增加可能反映了ICB治疗后向TCF1-效应样细胞的转变。鉴于上文提及的ICB治疗后CD8+ TILs中CXCR6增加以及CXCR6与TCF1的负相关，作者为了测试这一点，从野生型WT小鼠或携带条件性删除Tcf7（编码TCF1的基因）的成熟CD8+ T细胞（Tcf7 cKO）中分离的CD8+ TILs进行不同时间段的RNA测序。结果发现，CXCR6是WT和Tcf7 cKO细胞之间差异表达的前5个基因之一，无论在激活前还是随后的时间点，表达差异逐渐减少（图C）。此外，对WT和Tcf7 cKO小鼠的B16Ova肿瘤进行单细胞分析显示，Tcf7 cKO细胞中CXCR6表达显著增加，特别是在PD1-TIM3-和PD1+TIM3- CD8+ TILs中（图D）。作者在蛋白水平上也证实了这一发现（图E）。

这些结果表明Tcf7/TCF1在PD1-TIM3-和PD1+TIM3- CD8+ T细胞中抑制了CXCR6的表达；一旦TIM3表达，TCF1水平变得微不足道，这与TCF1作为转录抑制子的作用一致。最后，为了测试TCF1对CXCR6转录的抑制，作者在预测的TCF1结合位点周围的1kb基因组区域中鉴定了候选转录因子。作者发现这些转录因子中有15个在B16F10肿瘤中的CD8+ TILs中表达，包括AP-1转录因子家族的三个成员，c-Fos、c-Jun和JunD。因此，作者测试了AP-1转录因子是否可以诱导CXCR6表达以及这种诱导是否可以被TCF1抑制。通过荧光素酶结果显示c-Fos、c-Jun和JunD诱导了CXCR6转录，但在加入TCF1后，转录被抑制到对照水平（图G-I）。因此，TCF1抑制了AP-1诱导的CXCR6表达。

维持肿瘤控制需要CXCR6

接下来作者为了研究CXCR6表达对抗肿瘤CD8+ T细胞功能的影响，作者利用CRISPR-Cas9在成熟的CD8+ T细胞中删除CXCR6，并将这些细胞转移到携带表达Ova肿瘤的小鼠体内（图5A）。这种方法可使删除T细胞基因时，绕过了在发育过程中删除基因时可能出现的任何补偿机制。作者发现与CRISPR对照T细胞相比，在B16Ova和Mc38Ovahi模型中CRISPR CXCR6 KO T细胞未能控制肿瘤生长（图B-C），并且功能分析显示它们在增殖（Ki-67）、促炎细胞因子生产（IFNg和TNF-a）或细胞毒能力（GranzymeB+CD107a+）方面也没有差异（图D）。然而，与CRISPR对照细胞相比，PD1+TIM3+ CRISPR CXCR6 KO细胞中Tox表达减少（图E），而Tox已知会影响CD8+ TILs的生存。PD1+TIM3+ OTI细胞中表达CX3CR1的CRISPR CXCR6 KO细胞较少，且CX3CR1表达水平也趋于较低（图F）。由于CX3CR1表达与其他免疫细胞中促生存蛋白Bcl2的表达有关，作者进一步发现，PD1+TIM3+ CXCR6 KO OTI细胞中Bcl2表达细胞的比例和Bcl2表达水平显著低于WT OTI细胞（图H）。在PD1+TIM3+ CXCR6 KO OTI细胞中比WT OTI细胞中有更多的凋亡细胞（Annexin V+，7AAD+）（图I）。综合这些数据，可以得出结论：CXCR6-CXCL16相互作用可能通过调节PD1+TIM3+细胞的生存，可能是通过改变CX3CR1和Bcl2的表达，使CXCR6 KO细胞更易凋亡，因此在介导肿瘤清除方面效果较差。

CXCR6 KO细胞中缺乏CD28共刺激

为了进一步确定CXCR6信号如何影响T细胞，作者对WT和CXCR6 KO OTI细胞进行了RNA测序。结果显示，WT与CXCR6 KO OTI细胞中富集的前三个通路是白细胞激活、调节性T细胞分化的调节和CD28家族的共刺激（图A-B），而在CXCR6 KO OTI细胞中富集的通路是RNA代谢、核糖核蛋白复合物的生物合成和组装（图C）。基因集富集分析同样显示，WT与CXCR6 KO OTI细胞中“CD28通路共刺激”通路相关性很高（图D）。CD28信号不仅对有效的T细胞共刺激和T细胞生存至关重要，它对ICB响应也至关重要。因此，作者评估了在肿瘤转移到宿主后的早期（第3天）和晚期（第8天）时间点WT和CXCR6 KO OTI细胞中的CD28表达（图E）。转移后早期，WT和CXCR6 KO OTI细胞在肿瘤组织中的频率相似，但后来所有小鼠都显示出更高频率的WT细胞（图F），前面提及的CXCR6 KO细胞凋亡增加一致。值得注意的是，这些生存差异在共转移环境中更容易观察到，这可能反映了CXCR6 KO细胞在同一TME中与WT细胞竞争有限的生长和生存信号的能力降低。CXCR6 KO OTI细胞中CD28+细胞的频率在早期和晚期时间点都较低（图G），这与RNA测序数据一致（图A）。因为CD28共刺激直接与促生存蛋白Bcl-xL相关，所以可以看到CXCR6 KO OTI细胞中Bcl-xL表达细胞的频率和Bcl-xL表达水平较低（图H）。最后，CXCR6 KO OTI细胞中CX3CR1表达较低（图I），证实了之前的结果。总而言之，这些数据表明CD28调节可能是CXCR6有助于维持抗肿瘤T细胞反应的机制之一。

研究总结：

本文研究了CXCR6在CD8+ T细胞中的表达及其在抗肿瘤免疫中的作用。研究表明，CXCR6主要在T细胞中表达，其配体CXCL16主要由髓样细胞表达。通过分析不同肿瘤类型和小鼠模型的数据，发现CXCR6表达随着T细胞从效应状态向功能障碍状态转变而增加。进一步的实验显示，在接受ICB治疗的黑色素瘤患者和小鼠模型中，CXCR6表达显著增加，表明CXCR6可能在ICB响应中发挥作用。为了研究CXCR6在抗肿瘤CD8+ T细胞功能中的作用，作者利用CRISPR-Cas9技术在OTI CD8+ T细胞中敲除CXCR6，并将这些细胞转移到携带Ova肿瘤的小鼠体内。结果显示，与对照组相比，CXCR6 KO细胞未能有效控制肿瘤生长，尽管它们在增殖、促炎细胞因子生产和细胞毒性方面没有显著差异。然而，CXCR6 KO细胞中Tox表达减少，PD1+TIM3+细胞中凋亡增加，表明CXCR6可能通过影响细胞生存信号来调节抗肿瘤免疫反应。RNA测序分析揭示了WT和CXCR6 KO细胞之间的显著差异，特别是CD28家族的共刺激路径上。CD28信号对于T细胞的有效共刺激和生存至关重要。作者实验结果显示，CXCR6 KO细胞在肿瘤组织中的生存能力较差，且CD28和Bcl-xL表达水平较低。这些发现表明，CD28调节可能是CXCR6在维持抗肿瘤T细胞反应中的一个关键机制。总的来说，本文的结果支持了：CXCR6-CXCL16相互作用通过调节PD1+TIM3+细胞的生存，可能通过改变CX3CR1和Bcl2的表达，使CXCR6缺失细胞更易凋亡，因而在介导肿瘤清除方面效果较差。这些发现为进一步研究CXCR6在抗肿瘤免疫中的作用及其作为潜在治疗靶点提供了重要依据。