A molecular single-cell lung atlas of lethal COVID-19.
影响因子： 42.778
PMID：33915568
期刊年卷：Nature 2021 Apr 29;
综合性期刊一区 综合性期刊 Q1 1/64
DOI：10.1038/s41586-021-03569-1
https://www.nature.com/articles/s41586-021-03569-1#Abs1
摘要
呼吸衰竭是严重 SARS-CoV-2 感染患者死亡的主要原因，但对肺组织水平的宿主反应知之甚少。在这里，我们对 19 名死于 COVID-19 并接受快速尸检的个体和 7 名对照个体的肺中的约 116,000 个核进行了单核 RNA 测序。综合分析确定了细胞组成、转录细胞状态和细胞间相互作用的重大变化，从而提供了对致命 COVID-19 生物学的深入了解。COVID-19 患者的肺部高度发炎，异常活化的单核细胞衍生的巨噬细胞和肺泡巨噬细胞密集浸润，但 T 细胞反应受损。与其他病毒和细菌引起的肺炎相比，单核细胞/巨噬细胞来源的白细胞介素-1β 和上皮细胞来源的白细胞介素-6 是 SARS-CoV-2 感染的独特特征。肺泡 2 型细胞采用炎症相关的瞬时祖细胞状态，未能完全转变为肺泡 1 型细胞，导致肺再生受损。此外，我们确定了最近描述的扩展CTHRC1+病理性成纤维细胞导致 COVID-19 中迅速发生的肺纤维化。蛋白质活性和配体-受体相互作用的推断确定了破坏有害回路的假定药物靶标。该图谱可以解析致命的 COVID-19，可能有助于我们了解 COVID-19 幸存者的长期并发症，并为治疗开发提供重要资源。
引言
在全球范围内，由 SARS-CoV-2 感染引起的 COVID-19 大流行已导致超过 1.45 亿病例（美国为 3200 万）和 310 万例死亡（美国为 570,000；截至 4 月 26 日的数据，2021) 1 . 大约 15% 的感染者会发展为严重疾病，这可能表现为急性呼吸窘迫综合征 (ARDS)，并与大量发病率和死亡率相关2 , 4。
以前，单细胞RNA测序（scRNA-SEQ）健康个体的分析已经揭示所必需的SARS-CoV的-2条目宿主受体的组织分布5，6，7，和从患者的支气管肺泡灌洗液和血液检查不同严重程度的 COVID-19 已经确定了 SARS-CoV-2 感染对免疫反应和细胞因子失调的影响8 , 9 , 10 , 11 , 12. 然而，由于获取患者组织的实际限制，SARS-CoV-2在肺组织水平的影响尚不清楚。一系列尸检研究检查了死于 COVID-19 的个体的福尔马林固定石蜡包埋 (FFPE) 组织切片，扩展了我们对病毒器官性的理解，但这些研究在发现潜力方面受到低重分析（例如例如，免疫组织化学）和/或延长的验尸间隔（的PMI），该RNA的质量产生不利的影响13，14，15。
我们建立了快速尸检计划，并根据机构审查委员会批准的协议，在死亡数小时内从 COVID-19 患者身上收集速冻器官标本。我们对死于 COVID-19 的个体和对照个体的肺样本进行了单核 RNA-seq (snRNA-seq)，以构建一个图谱，可以深入了解 COVID-19 的病理生理学，并为进一步研究提供关键资源。
COVID-19 中的肺细胞景观
COVID-19 队列由 19 名患者（12 名男性和 7 名女性）组成，他们的中位年龄为 72 岁（范围，58 岁至超过 89 岁）（补充表1，扩展数据图1a），并接受了快速尸检。中位数尸检间隔 (PMI) 为 4 小时（范围，2-9 小时）。所有患者都存在与严重 COVID-19 16风险增加相关的潜在合并症（补充表1）。对照组包括 7 名个体（4 男 3 女），中位年龄为 70 岁（范围，67 至 79 岁），他们在 COVID-19 之前的时代接受了肺切除术或活检（补充表1）。
使用 snRNA-seq 17和集成的质量控制管道（参见 方法），我们生成了一个肺图谱，其中包含 116,314 个细胞核，其中 79,636 个来自 COVID-19 感染的肺，36,678 个来自对照肺（图1a）。我们使用三管齐下的方法进行细胞类型识别：聚类标记的无偏识别、使用来自报告图谱的特征发现细胞类型，以及使用专家知识手动管理以对细胞群和细胞状态进行细分（参见 方法）。我们报告了三个粒度级别的细胞类型分配：主要细胞类型、中间粒度和细粒度（补充表2）。我们使用UMAP（图1b、c、扩展数据图1b-d）来可视化降维数据。我们确定了九种主要细胞类型：上皮细胞 ( n = 30,070 个细胞)、髓细胞 ( n = 29,632)、成纤维细胞 ( n = 22,909)、内皮细胞 ( n = 5,386)、T 和自然杀伤 (NK) 淋巴细胞（n = 16,751)、B 淋巴细胞和浆细胞 ( n = 7,236)、神经元细胞 ( n = 2,017)、肥大细胞 ( n = 1,464) 和抗原呈递细胞 (APC；主要是树突细胞) ( n = 849）。在最细粒度的水平上，我们确定了 41 种不同的细胞类型（补充表2）。
图 1：研究设计和细胞景观
a，研究设计概述。b，UMAP 中的主要簇和各自的细胞类型分配。c，与b 中嵌入相同的细胞的起源。d，对照（n = 7）和 COVID-19 肺（n = 19）中主要细胞类型的比例。中线，中位数；框边缘，第 25 个和第 75 个百分位数；胡须，不超过 ±1.5 × 四分位距 (IQR) 的最极端点。Wilcoxon 秩和检验。
我们发现 COVID-19 和对照肺之间的细胞分数在全局（图1d）和免疫区室和非免疫区室（扩展数据图2a-c）之间存在显著差异。由于肺泡 II 型 (AT2) 和 I 型 (AT1) 细胞的丢失，以及单核细胞/巨噬细胞、成纤维细胞和神经元细胞的增加，上皮细胞区室减少；这些观察结果与供体性别无关（扩展数据图3a、b）。
我们发现COVID-19 和对照肺之间的ACE2、CD147（也称为BSG）、NPR1、TMPRSS2、FURIN或CTSL的表达没有重大差异（扩展数据图3c-f）。这表明细胞类型比例的变化与对病毒进入很重要的受体或假定蛋白酶的表达无关，尽管我们不能排除病毒介导的细胞死亡选择性消耗这些基因高表达的细胞的可能性。我们在两名患者（补充表3）中检测到 SARS-CoV-2 读数，其中一名患有 HIV/AIDS（CD4 +入院时T 细胞计数 29/mm ；在 28 个细胞中检测到 662 个独特的分子标识符），这表明原则上可以捕获病毒读数。
髓样细胞的异常激活
髓样细胞代表了COVID-19肺中的主要细胞成分，而且比对照肺（图更普遍有1D，扩展数据图2的A，C，图4a）。我们鉴定了单核细胞 ( n = 3,176)、单核细胞衍生的巨噬细胞 (MDMs; n = 9,534)、过渡 MDMs ( n = 4,203) 和常驻肺泡巨噬细胞 (AMs; n = 12,511)，它们作为扩散成分的不同轨迹被回收（DC）分析和COVID-19肺（图更频繁2a-c中，扩展数据图4B-I，补充表2，4，5）。来自 COVID-19 患者的骨髓细胞被高度异常激活。例如，COVID-19 肺中的 MDM 差异表达激活基因（例如CTSB、CTSD、CTSZ、PSAP）和两种长链非编码 RNA，NEAT1和MALAT1，它们与巨噬细胞异常激活和 T 细胞免疫受损相关18（扩展数据图5a，补充表5）。AMs 由胎儿单核细胞产生并可以自我更新19，在 COVID-19 肺中富集和高度激活（图2c，扩展数据图5a））。值得注意的是，COVID-19 AM 显示出肿瘤相关巨噬细胞受体 AXL 的 mRNA 和蛋白质表达强烈降低（图2d，扩展数据图5b、c），这是一种受体酪氨酸激酶，对于协调清除凋亡细胞（胞吞作用）很重要) 和随后的组织再生过程中的抗炎调节20。这些数据表明，髓样细胞是 COVID-19 炎症失调的主要来源。
图 2：COVID-19 中的免疫反应
a，突出免疫细胞簇的UMAP投影。b，使用前三个 DC 可视化髓样细胞。插图表示组分配。c，对照（n = 7）和 COVID-19 肺（n = 19）的髓样细胞分数。中线，中位数；框边缘，第 25 个和第 75 个百分位数；晶须：不超过±1.5 × IQR 的最极端点。Wilcoxon 秩和检验。d。对照和 COVID-19 肺组织中 CD169、AXL 和 DAPI（大图）的代表性免疫荧光染色；顶部，带有叠加层的选定区域；底部，个人频道。比例尺，20 微米。e , f , Top 20 经常检测到的IGHV –COVID -19 ( e ) 中的IGLV组合和相应的组注释 (f )。先前描述的抗 RBD 抗体的组合21。g，T/NK细胞的UMAP；插图，小组作业。h，i，GZMB ( h ) 和MKI67 ( i ) 在与g相同的嵌入中的RNA 表达（对数归一化）。
血浆和 T 细胞反应
为了深入了解肺中针对 SARS-CoV-2 感染的体液免疫，我们基于每个细胞的链和同种型, 通过确定可变重 ( IGHV ) 和轻 ( IGLV ) 的mRNA 共表达来鉴定浆细胞并重建免疫球蛋白（扩展数据图6a-c）（参见 方法；扩展数据图6d-k，补充表6）。IGHV1-18–IGLV3-20产生针对 SARS-CoV-2 刺突蛋白的受体结合域 (RBD) 的中和抗体 (S309)21，是常见的IGHV–IGLV 之一组合，这表明发生了协调的抗体反应（图2e，f，扩展数据图6l，m）。在 T/NK 细胞簇（图2g）中，我们区分了 CD8 + T 细胞（n = 3,561）、T 调节（T reg）细胞（n = 649）、其他 CD4 + T 细胞（n = 7,586）和NK 细胞 ( n = 2,141)。我们发现 COVID-19 肺中 T 细胞丰度没有显著增加，只有与 T 细胞活化和组织驻留相关的细胞因子和程序适度上调（图2g-i，扩展数据图7a-i））。尽管免疫反应模式变化很大（扩展数据图7j，k），但这些数据表明，在主要保留的体液免疫反应的背景下，受损的 T 细胞反应可能会导致 COVID-19 的致死结果。
肺泡上皮再生受损
在上皮区室中，我们确定了肺泡上皮细胞（AT1 和 AT2 细胞；n = 20,949）、气道上皮细胞（基底细胞、纤毛细胞、棒状细胞、杯状细胞和粘液细胞；n = 7,223），这是一个以炎症表达为特征的簇和细胞周期基因，包括IRF8、B2M、MKI67和TOP2A（循环上皮；n = 609），以及一个显示细胞外基质 (ECM) 成分COL6A3、COL1A2和COL3A1（ECM高上皮）高表达的簇; n= 1,179) (图3a, b，扩展数据图8A-C，补充表2，7）。
图 3：肺再生受损和炎症来源
a、b、研究的肺泡和气道上皮细胞的 UMAP ( a ) 和相应的组分配 ( b )。c，来自 COVID-19 和对照肺的 AT1 和 AT2 细胞的差异基因表达（对数归一化，缩放；参见 方法）。列，单个单元格；行，最高调节基因的表达。左栏，AT1（紫色）和 AT2（粉色）细胞的谱系标记。颜色编码的顶部泳道表示签名的表达强度（对数归一化；参见 方法）和组分配，如右侧所示。exp.，表达。d , e , ETV5和CAV1 的小提琴图分别在 AT2 和 AT1 细胞中的 mRNA 表达（对数归一化）；带有 Bonferroni 校正的 Wilcoxon 秩和检验。f，UMAP嵌入AT1和AT2细胞并鉴定DATP；插图表示小组分配。g，AT1和AT2细胞中DATP特征表达（对数归一化）的小提琴图。Wilcoxon 秩和检验。h，前三个 DC 显示了 AT2 和 AT1 细胞和 DATP 的主要轨迹、DATP 特征的表达和组分配（插图）。i，对照 ( n = 7) 和 COVID-19 肺 ( n = 19)中 DATP 和 AT 细胞的比例。中线，中位数；框边缘，第 25 个和第 75 个百分位数；晶须，不超过 ±1.5 × IQR 的最极端点。Wilcoxon 秩和检验。j，对照和 COVID-19 肺组织中 pro-SPC、KRT8 和 DAPI 的代表性免疫荧光染色；顶部，具有覆盖的代表性区域；底部，带有选定区域各个通道的小图像。比例尺，50 微米。k , l，健康肺组织中 IL-1β ( k ) 和 IL-6 ( l ) 的组织质量细胞计数定量，以及来自具有不同感染病因的供体的样本。每个点代表感兴趣区域 (ROI) 中 IL-1β 和 IL-6 的量化；带有 Benjamini-Hochberg 错误发现率 (FDR) 调整的双边 Mann-Whitney U检验。
AT2 细胞在肺再生22期间充当 AT1 细胞的祖细胞。对照肺中的 AT2 和 T1 细胞形成不同的簇（图3a、b）并证明了差异基因表达 (DGE) 分析的预期变化，包括AT2 细胞中谱系标记SFTPC和SFTPB的表达，以及AT1 中的CLIC5和AGER细胞（图3c，补充表7）。相比之下，COVID-19 肺中 AT2 和 AT1 细胞的聚类不那么离散，很大一部分细胞不与其对照对应物重叠（图3b））。来自 COVID-19 肺的 AT2 和 AT1 细胞均显示出定义标志物的整体表达降低（图3c）。COVID-19 AT2 细胞显示ETV5表达降低（图3d），这是一种维持 AT2 细胞身份所需的转录因子。降低的ETV5表达与向 AT1 细胞的分化相关23，表明 AT2 细胞已启动再生程序（图3d，扩展数据图8d）。CAV1是 AT1 晚期成熟的标志物24，在来自 COVID-19 肺的 AT1 细胞中以显著较低的水平表达（图3e））。总体而言，这些数据表明 COVID-19 肺中 AT2 到 AT1 细胞的转化不完全。
最近的研究表明，炎症可以诱导细胞状态，其特征是不能完全转变为 AT1 细胞；这已被称为“损伤相关瞬态祖细胞”（DATPs），“肺泡分化中间”（ADI），或“预AT1移行细胞状态”（PATS）25，26，27（以下简称为DATPs）。我们使用 DATP 标记基因（KRT8、CLDN4和CDKN1A）25 的表达来开发 DATP 特征（参见 方法；扩展数据图8e-h，补充表8）并发现来自 COVID-19 肺的肺泡上皮细胞在表达该特征方面的得分明显高于来自对照肺的细胞（图3f、g，扩展数据图8i）。DC 分析将主要轨迹从 AT2 分离到 AT1 细胞，而 DATP 主要位于 AT2 和 AT1 细胞之间（图3h，扩展数据图8j-n）。与分化的 AT2 或 AT1 细胞相比，DATP 的基因集富集分析 (GSEA) 显示 TNFα 和 p53 信号的富集，以及通过 HIF-1α 的缺氧反应（扩展数据图8o），与 DATP 中涉及的途径一致在小鼠模型中27. 与 p53 信号的过度表达一致，大多数 DATP 没有经历细胞分裂（扩展数据图8p），表明它们在 DATP 细胞状态中停滞。
DATP 在 COVID-19 中比对照肺更频繁（图3i）。相应组织的免疫荧光染色显示 KRT8 +和 CLDN4 + DATP 在 COVID-19 肺中的频率较高（图3j，扩展数据图8r，s），我们观察到随着时间的推移，AT1 细胞丰度逐渐丧失。症状发作至死亡（扩展数据图8t）。总体而言，这些数据表明，除了病毒感染直接破坏肺泡上皮外，COVID-19 患者的肺再生过程也会受损。
我们接下来确定了导致 DATP 细胞状态，更一般地说，导致 COVID-19 肺部高炎症环境的炎症来源。在 mRNA 水平捕获炎性细胞因子白细胞介素 (IL)-1β（和其他）可能是有限的，因为 IL-1β 的生物活性形式在触发 DATP 中起主要作用25，是通过从 pro-IL 裂解产生的-1β 炎症小体激活时；因此，蛋白质水平评估提供了补充信息。为此，我们利用了最近发布的高分辨率成像质量细胞计数数据集，该数据集对来自 23 个个体（包括健康对照）的 237 个组织区域进行了分析；流感肺炎、细菌性肺炎或ARDS患者；和 10 名死于 COVID-19 的患者28. IL-1β 在 COVID-19 患者的单核细胞和巨噬细胞中的表达比健康个体或其他疾病组的患者更强（图3k，扩展数据图9a-c）。IL-6 是 COVID-19 病理生理学中调用的另一种关键炎症细胞因子，它在 COVID-19 患者的上皮细胞中更丰富，但与其他疾病组的患者相比，这些患者的巨噬细胞中没有差异表达（图 1）。3l，扩展数据图9d-f）。最后，我们发现 COVID-19 患者的 I 型干扰素和干扰素反应基因在各种细胞类型（包括 AT2 细胞、单核细胞和巨噬细胞）中的表达强于对照供体（扩展数据图9g、h） . 总之，这些数据表明，与其他病毒性或细菌性肺炎相比，髓源性 IL-1β 可能是 COVID-19 的一个显著特征，并且可能有助于诱导和维持 DATP 细胞状态。
COVID-19 中的异位簇状细胞
中捕获的气道上皮细胞，我们回收四个不同的轨迹：KRT5+TP63+基底（Ñ = 534），俱乐部（Ñ = 1232），和杯状细胞（Ñ = 1757），和一个轨迹具有较少细胞（Ñ = 110）这主要在 COVID-19 肺中发现，我们将其确定为推定的簇状细胞（扩展数据图10a-e）。簇状细胞参与气道炎症和肠组织再生29，但它们在病毒性肺炎中的作用仍不清楚。簇绒单元的数量（CHAT +或 POU2F3 +) 在 COVID-19 患者的上呼吸道中增加了三倍，并且它们异位存在于 COVID-19 的肺实质中，但不存在于对照肺中（扩展数据图10f-k）。为了开始阐明簇状细胞在病毒性肺炎中的假定作用，我们用 PR8（一种实验室适应的 H1N1 流感病毒株）感染了缺乏簇状细胞的野生型和Pou2f3-/-小鼠（参见 方法）。与对照相比，Pou2f3-/-小鼠的肺显示巨噬细胞浸润减少和趋化基因（包括Ccl3和Ccl8) 也参与将髓细胞募集到死于 COVID-19 的个体的肺部（扩展数据图9 g、h、11a-l）。尽管需要进一步研究它们的作用，但这些异位簇状细胞可能有助于 COVID-19 的病理生理学（补充讨论）。
病理性成纤维细胞和肺纤维化
COVID-19肺中的成纤维细胞明显多于对照肺（图1d）；α-平滑肌肌动蛋白 (α-SMA) 的免疫组织化学染色证实了这一发现（扩展数据图12a-d）。纤维化程度（由 Sirius red 纤维化评分确定，参见 方法）与疾病持续时间相关（图4a），表明 COVID-19 中肺纤维化随时间增加。我们确定了五种成纤维细胞亚型：肺泡 ( n = 4,670)、外膜 ( n = 3,773)、病理性 ( n = 2,322)、中间病理性 ( n = 8,779) 和其他 ( n = 1,099)（图4b）, 扩展数据图12e )。成纤维细胞簇差异的主要驱动因素是与对照肺相比，COVID-19 肺中病理或中间病理成纤维细胞（以下统称为 pFB）的频率增加（图4c，扩展数据图12f）。pFB 强烈表达*****CTHRC1*****，这是最近描述的定义这些细胞的标志基因，以及病理性 ECM 3 基因，包括COL1A1和COL3A1（扩展数据图12e，补充表9）。在小鼠模型和特发性肺纤维化 (IPF) 或硬皮病3患者中，pFB 是肺纤维化的关键驱动因素。它们增加的频率表明 pFB 促进了 COVID-19 患者快速发展的肺纤维化。**
图 4：COVID-19 中的病理性成纤维细胞和随后的纤维化。
a，COVID-19 样本（n = 16，参见 方法）中从症状出现到死亡和纤维化评分的天数测定系数 ( R 2 )。误差带，皮尔逊相关性的 95% se 间隔。b，成纤维细胞（FB）亚群的 UMAP；插图表示小组分配。path., 病态的。c，对照（n = 7）和COVID-19肺（n = 19）的所有成纤维细胞中病理成纤维细胞的分数。中线，中位数；框边缘，第 25 个和第 75 个百分位数；晶须，不超过 ±1.5 × IQR 的最极端点。Wilcoxon 秩和检验。
鉴于成纤维细胞在肺生态系统重塑中的重要性，我们接下来研究了所有主要细胞类型（包括成纤维细胞）的配体 - 受体相互作用（参见 方法）。在所有细胞中丰富的推断配体 - 受体相互作用中有 TGFβ1-TGFβ 受体 2 和 BMP6-ACVR1（扩展数据图12g-i，补充表 10），它们分别属于 TGFβ 家族和超家族。TGFβ 信号传导在促进肺纤维化方面具有重要作用，并且与成纤维细胞介导的 ADI 维持有关27，这与 DATP 细胞状态密切相关。为了研究针对 pFB 的潜在治疗策略，我们从单核转录组推断蛋白质活性，然后将 pFB 与其他成纤维细胞进行比较。该分析预测 pFB 将显示 JunB 和 JunD 的活性增加（扩展数据图12j，补充表 11），它们通过增强的 TGFβ 和 STAT3 信号在小鼠模型中诱导肺纤维化，并与增加的 IL-1β 产生相关30。最后，我们推断了 pFB 中的可成药靶标（参见 方法），并将 MMP14 和 STAT3 确定为取消 pFB 中有害程序的潜在靶标（扩展数据图12j，补充表 11 )。
讨论
我们使用短 PMI 尸检标本和对照肺样本生成了 COVID-19 的单细胞转录组肺图谱。我们的分析提供了对致命 COVID-19 的细胞景观、细胞程序和细胞回路的广泛普查。蛋白质活性和细胞间相互作用的额外推断，以及使用成像质谱数据分析各种细胞类型的炎性细胞因子，为 SARS-CoV-2 感染肺部的有害后果提供了一个详细的视角。
我们的分析表明，产生 IL-1β 的异常激活的单核细胞/巨噬细胞之间存在相互作用，炎症诱导的肺泡上皮再生受损，以及促进纤维化并可能损害再生的病理性成纤维细胞的扩增（扩展数据图12f，k，补充讨论）。除了这些有害事件外，我们的数据表明，尽管可能存在足够的体液免疫反应（补充讨论），但死于 COVID-19 的个体肺部 T 细胞反应不足。最近的一项研究表明，感染 COVID-19 的癌症患者的 B 细胞功能受损与死亡率增加无关31，但缺乏足够的 CD8+ T 细胞反应（即使存在足够的体液免疫）与较差的病毒控制和增加的死亡率有关31。尽管我们的 COVID-19 队列不包括癌症患者，但这些数据表明，虽然在针对 SARS-CoV-2 的 T 细胞免疫充足的情况下，体液免疫可能是可有可无的，但我们的患者可能缺乏适当的 T 细胞反应导致了致命的后果。
尽管我们的研究深入了解了宿主对致命 SARS-CoV-2 感染的反应，但它受到样本量较小的限制。然而，通过协调努力，我们的工作将为一系列研究做出贡献，包括 TM Delorey 等人的配套论文。32，具有简化的协议和统一的元数据，以实现集成和组合分析，并将有助于解释重要的协变量。此外，由于我们的分析侧重于死于 COVID-19 的患者的肺组织，因此我们仅检查了潜在疾病表型的一个子集。尽管如此，一些观察结果，例如肺纤维化的快速发展（补充讨论）)，可能与从严重 COVID-19 中幸存下来的患者相关，并可能让我们了解这些人33的长期并发症。
总之，我们从短 PMI 组织标本中生成了分子单细胞肺图谱，并确定了致命的 COVID-19 的病理回路。该图谱为研究宿主对 SARS-CoV-2 的反应和了解 COVID-19 引起的潜在长期肺部后遗症建立了重要资源，并为严重疾病的治疗开发提供了基础。
