发表单位：浙江大学生命科学学院
发表期刊：Nature communications
影响因子：14.7
发表时间：2025年1月
水稻（Oryza sativa）作为全球超过半数人餐桌上的主食，其独特的须根系特征使其成为研究谷类作物根性特征的理想模型。根生长角度（RGA），即植物根系向重力方向生长的模式，是决定土壤中根系结构（RSA）的关键因素之一。尽管目前已识别出若干影响RGA的基因，但水稻中调控这一过程的分子机制尚待进一步阐明。
近日，浙江大学生命科学学院毛传澡课题组在Nature communications期刊上发表题为“A root system architecture regulator modulates OsPIN2 polar localization in rice”的研究论文，研究克隆了水稻根构型重要调控因子OsGLS1，揭示了OsGLS1调控生长素转运体OsPIN2极性分布的新机制，阐明了OsGLS1调控水稻根构型和养分吸收效率的分子机理，为作物养分吸收效率的遗传改良提供了理论基础和遗传材料。
技术路线
研究结果
根系结构（RSA）在植物的吸水、营养摄取以及稳固扎根于土壤中扮演着关键角色。根生长角度（RGA），即植物根系响应重力矢量生长的模式，是塑造土壤中根系结构的一个至关重要的因素。众多基因被认为在调控水稻的RGA过程中发挥作用。
特别是，OsPIN1、OsPIN2以及OsAUX1这三个基因编码的生长素运输蛋白，通过在重力感应的柱细胞与伸长的表皮细胞间传递生长素，从而影响根系的重力反应。尽管已知存在多个影响RGA的基因，但水稻中调控这一过程的分子机制尚不清晰。
在之前的研究工作中，研究者通过对甲磺酸乙酯（EMS）处理的秀水63（XS63）突变体群体进行筛选，成功分离出具有较浅根系结构且重力响应缺陷的gls1突变体。研究揭示，gls1突变是由单个隐性基因引起的，且该基因定位于第4号染色体上。
1. OsGLS1在水稻生长及发育过程中的生物学功能
为了深入探究OsGLS1在水稻生长及发育过程中的生物学功能，研究对比了gls1突变体与野生型XS63在营养液培养条件下的表型特征（图1a，b）。发现OsGLS1在调控植物生长方面起到了负调控作用，并在控制根系结构变化的中扮演着关键角色。
为了测试gls1突变体较浅的根系是否有助于土壤中的营养吸收，作者用含有15N标记的尿素和复合肥料对盆栽水稻进行了施肥。在施肥后所有时间点上，gls1稻穗中的P、K、Ca和Mg浓度也显著高于XS63。这表明gls1突变体在土壤中表现出更高的营养吸收能力。
作者通过对gls1和XS63植物在温室和稻田中的生长表现进行研究（图1c–e），发现OsGLS1的突变有助于改善水稻对土壤中的营养吸收和籽粒产量。
为了确定OsGLS1是否直接调节营养吸收或运输，作者测量了在含有15N标记尿素的营养液培养中生长的gls1和XS63的营养浓度。发现OsGLS1的突变对水培培养水稻的营养吸收和运输没有影响。
图1 gls1突变体在土壤中具有较浅的根系，却能提供更高的谷物产量。a在直径为8厘米装满了无菌土壤的花盆中培育21天，使用X射线计算机断层成像技术生成的野生型XS63和gls1突变体幼苗的根系结构。b 使用ImageJ测量XS63和gls1的根系生长角（θRGA）。XS63和gls1 的（c）：代表图片、（d）：穗数、（e）：单株产量 、（f）：总氮 （N;） 、（g）：总磷 （P）
2. gls1中观察到的异常根系结构是由OsGLS1突变引起的
作者通过将gls1与Kasalath（一种印度品种水稻）杂交，对获得的F2分离群体对gls1突变位点进行了精细定位。发现gls1在LOC_Os04g01160基因的第二外显子中存在一个G碱基插入，这一插入产生提前终止密码子，导致翻译提前终止。
为了验证gls1较大根系结构是否由LOC_Os04g01160（以下简称OsGLS1）的突变所引起，作者构建了一个互补表达载体，并将互补表达载体转化进gls1突变体中，得到的互补株系命名为gls1 GLS1pro:GLS1-GFP。对互补株系gls1 GLS1pro:GLS1-GFP进行RGA和其他根系特性分析，发现其与XS63相似，这表明OsGLS1是导致gls1突变体表型的因果基因，且GLS1-GFP融合蛋白有生物学功能（补充图6c, d）。
图2 基于图谱的OsGLS1克隆及互补测验
为进一步确认OsGLS1的突变是否是植物异常根生长角度RGA的原因，作者采用CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术在黑粳2号（HJ2，一种生长周期短的水稻品种）中生成了三个gls1的等位基因突变体，分别命名为gls1-2、gls1-3和gls1-4。
在这三个突变体中，gls1-2、gls1-3和gls1-4在OsGLS1的第二外显子中分别发生了4个、5个碱基对的缺失和1个碱基对插入，这些突变导致了OsGLS1基因的移码突变和提前终止密码子。结果显示，与HJ2幼苗相比，三个突变体的RGA显著高于HJ2。该结果证实了gls1中观察到的异常根系结构是由OsGLS1的突变引起的。
3. OsGLS1在根外层细胞层中的质膜上呈极性定位且其Ser-30位点的磷酸化对其极性定位至关重要
作者通过培育了HJ2的转基因系（GLS1pro：GUS）以研究OsGLS1的表达模式。通过对GLS1pro：GUS的GUS染色与RT-qPCR分析，发现OsGLS1在不同组织中普遍表达，在幼苗期（7天龄）在茎基和根尖（距根尖0-1厘米）和开花期（50天龄）的旗叶中表达量较高。
利用gls1-2 GLS1pro：GLS1-GFP互补株系，作者对OsGLS1进行了亚细胞定位实验，发现OsGLS1在根外细胞层细胞基部质膜上呈极性定位。使用FM4-64染色对细胞质膜进行复染，发现下部和基部质膜的GLS1-GFP与FM4-64的比值显著高于上部和中部质膜，表明OsGLS1在下部和基部质膜的丰度更高。此外，在细胞质中检测到微弱的GLS1-GFP 信号。通过免疫组织化学染色法，发现OsGLS1-GFP主要定位于根表皮、外皮和厚壁组织细胞的基部质膜。这些结果表明OsGLS1是一种极性定位的蛋白，主要定位于根外细胞层的细胞基部质膜。
为了确定OsGLS1的哪个区域对其在质膜上的极性定位至关重要，作者构建了携带不同OsGLS1截断片段与GFP融合的转基因植物。发现，与GFP融合的GLS1第1-170位氨基酸片段（GLS11–170-GFP）在根表皮细胞质膜上展现出与全长GLS1-GFP相似的极性定位。而GLS1171–690-GFP和GLS1120–690-GFP在质膜上呈现非极性定位，并在细胞核中积累，且GLS180–690-GFP和GLS140–690-GFP融合蛋白未能定位到根表皮细胞的质膜上，这表明N端的前39个氨基酸对于OsGLS1在质膜上的极性定位是必不可少的。
已知磷酸化是影响蛋白质在质膜上极性定位的关键机制。因此，作者利用IP-MS对7日龄的gls1-2 GLS1pro:GLS1-GFP进行磷酸化位点分析，鉴定出了三个磷酸化位点（Ser-30、Thr-644和Thr-654）。
为了探究这些磷酸化位点是否对OsGLS1在质膜上的极性定位起作用。作者分别使用载体GLS1pro:GLS13D-GFP（天冬氨酸取代三个磷酸化位点）和GLS1pro:GLS13A-GFP（丙氨酸取代三个磷酸化位点）转入gls1-2，并观察它们是否能够互补突变表型。结果显示，gls1-2 GLS1pro:GLS13D-GFP幼苗的RGA几乎完全恢复至HJ2水平，而gls1-2 GLS1pro:GLS13A-GFP幼苗的RGA与gls1-2相似。
此外，只有GLS13D-GFP在基底质膜上显示出与GLS1-GFP类似的极性定位。这些数据表明，这三个磷酸化位点对OsGLS1的极性定位至关重要。
序列比对显示，Ser-30在大多数OsGLS1样蛋白中是保守的，猜测其磷酸化对OsGLS1的极性定位具有重要作用。为了验证这一假设，作者构建了gls1-2 GLS1pro:GLS1S30A-GFP（Ser-30被丙氨酸取代）和gls1-2 GLS1pro:GLS1S30D-GFP（Ser-30被天冬氨酸取代）的转基因系。作者选择了两个具有相似OsGLS1转录水平的代表性独立转基因系进行表型分析。作者发现，只有GLS1S30D-GFP在基底质膜上显示出极性定位。
此外，gls1-2 GLS1pro:GLS1S30D-GFP幼苗的RGA恢复至接近HJ2水平，而GLS1pro:GLS1S30A-GFP未能恢复突变表型。这些结果证实，Ser-30的磷酸化对于OsGLS1在质膜上的极性定位是不可或缺的。
图3 在gls1-2 GLS1pro:GLS1-GFP（GLS1-GFP；a）、gls1-2 GLS1pro:GLS1S30A-GFP（GLS1S30A-GFP；c）和gls1-2GLS1pro:GLS1S30D-GFP（GLS1S30D-GFP；e）转基因株系的初生根细胞中，观察了不同GLS1-GFP变体的定位（绿色荧光）和FM4-64染色（品红色荧光）。对图a（b）、c（d）和e（f）中白色虚线箭头所指的GFP和FM4-64的荧光强度进行了定量分析。S表示荧光强度测量的起点。白色箭头标记了GLS1-GFP的极性；黑色箭头指示了图a、c和e中根尖的方向；图g展示了野生型HJ2、gls1-2突变体以及GLS1S30A-GFP和GLS1S30D-GFP转基因株系在发芽纸上生长7天后的根表型和根生长角度（θrga；图h）
4. OsGLS1和OsPIN2存在遗传互作
作者之前的研究揭示了OsPIN2在水稻中扮演着调控根系结构的关键角色。OsPIN2主要在根表皮、外皮层和厚壁组织细胞中表达，而pin2突变体的根系结构相对较浅。鉴于OsGLS1与OsPIN2具有相似的表达模式，并且它们的突变体表型有所重叠，这暗示了两者之间可能存在遗传互作，作者在HJ2背景下将gls1-2突变体与pin2突变体进行了杂交，从而产生了pin2 gls1双突变体。
对7日龄的幼苗和4周龄的植株进行的表型分析表明，pin2 gls1双突变体在不定根数量、主根长度和根毛长度方面与pin2突变体相似，但显著低于gls1-2突变体。此外，pin2 gls1双突变体的根冠角度（RGA）与gls1-2突变体相似，且显著大于pin2突变体。这些发现表明，OsGLS1和OsPIN2可能通过共同的遗传途径参与根的生长和发育。
5. OsGLS1调控OsPIN2的丰度和亚细胞定位
通过RT-qPCR分析，作者发现gls1突变体与野生型XS63根中参与生长素生物合成的OsYUCCA基因表达水平并无显著差异。
为了探究gls1突变体中生长素的分布是否受到影响，作者采用了DR5:VENUS和DR5:GUS报告基因载体（由合成生长素响应启动子DR5驱动VENUS或GUS的表达）转化到XS63中，并将这些转化系与gls1杂交，利用报告基因体系，通过VENUS荧光和GUS染色作者观察到（图3a，b），gls1突变体中的正常生长素信号输出受到了影响。这些观察结果提示OsGLS1可能参与调控生长素的分布。
RT-qPCR分析进一步确认，参与生长素运输的OsAUX和OsPIN基因在gls1与XS63之间的表达水平是相当的。
为了检测OsGLS1是否可能调节生长素运输蛋白的丰度，作者在XS63中构建了AUX1pro:AUX1-GFP和PIN2pro:PIN2-GFP转基因系，并将它们与gls1杂交，以获得gls1 AUX1pro:AUX1-GFP和gls1 PIN2pro:PIN2-GFP转基因系。作者发现OsGLS1的突变并不影响根尖中OsAUX1、OsPIN1a或OsPIN1b的定位或丰度。
同时，PIN2-GFP蛋白在gls1PIN2pro:PIN2-GFP幼苗根中的丰度显著高于XS63中的PIN2pro:PIN2-GFP。PIN2-GFP在XS63根表皮细胞中总是定位到顶部质膜，但在gls1突变体中，PIN2-GFP并未在根表皮细胞质膜上显示出极性定位（图3c–f）。
通过使用抗OsPIN2抗体对XS63和gls1根尖的纵向切片进行免疫组织化学染色，作者确认了OsPIN2在XS63大多数根表皮、外皮层和厚壁组织细胞中的顶部呈极性定位（约74.8%）。
值得注意的是，在gls1的大多数（约74.9%）根外细胞层中，OsPIN2在细胞顶部和基部质膜之间均匀分布。但在gls1和XS63的根皮层细胞中，OsPIN2在细胞基部质膜均呈现为极性定位（图3g, h）。这些结果揭示了OsGLS1对于根表皮、外皮层和厚壁组织细胞中OsPIN2在质膜上的正常丰度和极性定位具有重要作用。
图4 7日龄DR5根尖的GUS染色：XS63和gls1背景中的GUS幼苗垂直生长
6. OsGLS1与OsPIN2存在物理互作
为探究OsGLS1与OsPIN2之间是否存在物理互作，作者采用酵母膜系统双杂交来验证，实验结果表明（图a），在酵母细胞中，OsGLS1与OsPIN2确实存在相互作用。
进一步分析揭示，这种相互作用主要定位于OsGLS1的C端区域，特别是包含VWA结构域的部分，而N端含RING结构域的区域则未参与相互作用；Pull-down实验中，验证了OsGLS1C与OsPIN2HL之间的相互作用（图4b）。
此外，通过Co-IP实验，作者发现OsGLS1能与OsPIN2HL结合（图4c）。BiFC实验在植物细胞质膜（PM）上证实了OsGLS1与OsPIN2HL在质膜上存在相互作用（图4d）。
综上所述，这些实验结果一致表明，无论是在体外还是体内，OsGLS1与OsPIN2均存在互作。
图5 OsGLS1与 OsPIN2互作
7. OsGLS1直接泛素化并降解OsPIN2
OsGLS1蛋白含有一个RING结构域，通常该结构域负责行使E3泛素连接酶的功能。为了验证OsGLS1是否具备E3泛素连接酶的活性，作者构建了一个仅包含RING结构域的OsGLS1截短变体（氨基酸1-240），并将其与GST融合，命名为GST-GLS1N。在存在E1、E2和泛素-Flag的条件下，作者发现GST-GLS1N能够自我泛素化。表明OsGLS1确实具有E3泛素连接酶活性。
鉴于OsPIN2与OsGLS1存在相互作用，并且OsPIN2在gls1突变体中的数量和定位发生了变化，作者推测OsGLS1可能通过介导泛素化和降解过程来调节OsPIN2的稳定性。
为了验证这一假设，作者使用来自XS63或gls1幼苗根部的蛋白提取物与重组麦芽糖结合蛋白（MBP）标记的PIN2HL-HIS进行反应。结果显示，在XS63提取物中，MBP-PIN2HL-HIS在30分钟内被降解，而MBP-HIS则保持稳定；而在gls1提取物中，MBP-PIN2HL-HIS即使在60分钟后仍未完全降解（图5a，b）。
值得注意的是，在XS63提取物中，MBP-PIN2HL-HIS的降解可被26S蛋白酶体抑制剂MG132阻断，表明26S蛋白酶体参与了OsPIN2的降解过程（图5a）。
为了进一步探究OsGLS1在水稻根部对OsPIN2降解的作用，作者在XS63和gls1背景下培育了表达35S:PIN2HL-GFP的转基因植物。
免疫印迹分析显示，在蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺（CHX）处理后，PIN2HL-GFP在XS63中的降解速率显著快于在gls1中；在CHX处理15分钟后，XS63中约50%的PIN2HL-GFP已降解，而在gls1中，PIN2HL-GFP水平在处理前15分钟内保持不变，90分钟后才降解约50%（图5c，d）。
此外，当OsGLS1在水稻原生质体中共表达时，质膜定位的OsPIN2数量显著减少。这些数据表明，OsGLS1在水稻中调控OsPIN2的降解。
为了确定OsGLS1是否通过泛素化直接促进OsPIN2的降解，作者检测了在XS63和gls1PIN2HL-GFP转基因植物中，经MG132处理的PIN2HL-GFP的泛素化水平。发现，与XS63相比，gls1中的PIN2HL-GFP泛素化水平显著降低（图5e）。
体外泛素化实验进一步显示，在GST-GLS1C、泛素-Flag、E1和E2的存在下，重组PIN2HL能够被泛素化，而在缺乏GST-GLS1C的情况下，则无泛素化发生（图5f）。
综上所述，这些结果证实了OsGLS1直接参与泛素化并促进OsPIN2的降解。
图6 OsGLS1 在体外和体内实验中都能直接对 OsPIN2 进行泛素化修饰并使其降解
小源直通车
作者通过对水稻品种秀水63（XS63）进行乙基甲磺酸（EMS）诱变，从中筛选出一种具有根重力生长缺陷的突变体，并从中分离获得了gls1突变体，该突变体的根系统结构表现较浅。
在本研究中，作者克隆了导致gls1突变的关键基因，并深入解析了其如何影响根系结构的形成，以及其在提升营养吸收效率和增加籽粒产量方面的育种潜力。这一研究成果揭示了OsGLS1调节水稻根生长角度的分子机制，即在Ser-30位点磷酸化的OsGLS1极性定位于根外细胞层的细胞基部质膜。OsGLS1直接泛素化和降解OsPIN2，导致OsPIN2在顶部质膜的极性积累，从而建立典型顶部质膜定位的OsPIN2定位模式，促成生长素极性分布，最终形成根构型。
与野生型相比，在gls1根中OsPIN2的极性定位模式消失，根尖生长素的极性定位模式改变，从而产生更大的根生长角度。这一发现为培育具有高效营养吸收根系结构和高产潜力作物的新品种提供了重要的靶标。
图7 OsGLS1–OsPIN2 调控水稻根系结构的工作模型
