题目：Single-Cell RNA-Seq of T Cells in B-ALL Patients Reveals an Exhausted Subset with Remarkable Heterogeneity
发表期刊：Advanced Science(IF:16.806)
发表年份：2021-08-08
摘要
背景：功能性T细胞亚群特征是制定免疫治疗策略和预测白血病临床反应的关键。
方法：从健康个体和急性B淋巴细胞白血病 (B-ALL) 患者的外周血中分选出 T 细胞，进行单细胞转录组测序。根据基因表达，无监督聚类将细胞分为13 个 T 细胞亚群。在 B-ALL 患者中发现了健康个体的所有 11 个主要 T 细胞亚群，B-ALL中T细胞显示出更多的免疫通路活化特征。B-ALL中有2个耗竭性T细胞群，其特征是 TIGIT、PDCD1、HLADRA、LAG3 和 CTLA4高表达。值得注意的是，这些耗竭性T细胞群具有显着的异质性，将其并进一步分为 10 个亚群，具有不同的细胞周期阶段、navie状态和 GNLY（编码颗粒溶素）表达模式特征。结合TCR分析，揭示B-ALL 中耗竭性 T 细胞的不同来源，克隆扩增的耗竭性T细胞可能来自CD8+ 效应记忆/终端效应细胞（CD8+ effector memory/terminal effector cells）。
实验设计及质控
样本：3个B-ALL患者和2名健康对照样本的外周血单核细胞(Peripheral blood mononuclear cells ,PBMCs)
细胞前处理： 流式分选，其中使用到的流式抗体包括CD45，CD3，CD4和CD8。
细胞过滤标准： more than 800 genes and 2000 UMIs and less than 15% of reads mapped to mitochondrial genes were retained.因为作者主要关注免疫细胞，接着 用CD3D, CD3E, CD3G, CD247 genes 这4个基因的平均表达量作为CD3的平均表达量，如果CD3平均表达值>0.5,则纳入下游分析。此外只保留在至少10个细胞以上有表达值得细胞。最后，总共剩下28842(健康对照样本哟12 699个细胞，B-ALL患者有16143个细胞）进入下游分析。
结果
1.在 B-ALL 患者中特别发现了两群耗竭性T细胞亚群
首先，无监督聚类分析发现，健康个体的T细胞可以分为11 群，而B-ALL患者的T细胞可以分为13 群（Fig 1B）。
2. 不同的 T 细胞亚型在 B-ALL 中普遍表现有更多的激活特征
接下来，接着他们将健康个体和 B-ALL 患者的所有 T 细胞结合起来分析。健康个体中中 11 个 T 细胞亚群与 B-ALL 患者中的相应的亚群聚合在一起展示（Fig 2A）。成对 Pearson 相关分析还表明，两组患者的 T 细胞簇具有相似的表达模式（除了CD4_Exhau 和 CD8_Exhau，Fig 2B）。
3. B-ALL 中耗竭 性T 细胞的转录组学异质性
接着他们重点放在耗竭性T细胞亚群上。首先 CD4/CD8耗竭性T细胞亚群可进一步细分为10个亚群（Fig 3A）。这10个亚群显示表达不同水平的耗竭性marker，并且与细胞周期状态、naive状态或 GNLY 表达相关等表达模式组合时，每个亚群似乎并不重叠或者说互相靠近。Ex_CD4 和 Ex_CD4_GNLY+、Ex_CD8 和 Ex_CD8_GNLY+、Ex_CD4_cc 和 Ex_CD4_cc_GNLY+，以及 Ex_CD8_cc 和 Ex_CD8_cc_GNLY+ 可根据GNLY 表达水平区分开来（Fig 3C）。
Ex_CD4 和 Ex_CD4_GNLY+、Ex_CD8 和 Ex_CD8_GNLY+、Ex_CD4_cc 和 Ex_CD4_cc_GNLY+，以及 Ex_CD8_cc 和 Ex_CD8_cc_GNLY+ 被 GNLY 表达水平区分开来（Fig 3C）。此外，GSEA比较了四个耗竭性的 GNLY+ 亚群（Ex_CD4_GNLY+、Ex_CD8_GNLY+、Ex_CD4_cc_GNLY+ 和 Ex_CD8_cc_GNLY+）通路富集变化。结果表明， GNLY +的亚群在 TCR 信号通路、自然杀伤细胞介导的细胞毒性和细胞因子-细胞因子受体相互作用中被激活（Fig S4D）（备注：原图不清晰，所以没放上来）。因此，他们得出结论，T细胞的GNLY 的表达量与其具有更高的细胞毒性能力呈正相关。总的来说，耗竭性T 细胞应被视为一个具有异质性质的“细胞室”，里面由处于不同状态的 T 细胞组成，可能具有不同的生物学功能。
4.TCR分析表明 B-ALL 患者存在广泛的 T 细胞转变
接下来进入TCR部分。为了确定 B-ALL 状态下发生克隆性 T 细胞扩增的程度，他们对 B-ALL 患者的 T 细胞进行了克隆分析（Fig 4A）。（备注：3种颜色对应3个 TCR 克隆扩增组，其中“> = 3”表示至少有三个 T 细胞表达相同的 TCR 克隆型，“2”表示有两个 T 细胞表达相同的 TCR 克隆型，“1” ”表示只有一个 T 细胞表达的 TCR 克隆型)。
克隆扩增的细胞主要处于 G0/G1 期，并高度表达细胞毒性效应分子颗粒酶 B 和 H（GZMB 和 GZMH）、FGFBP2、GNLY、NKG7、KLRD1 和趋化因子 (CCL5)（Fig 4B and C）。
富集分析表明，这些细胞更多地参与抗原加工和呈递、淋巴细胞活化、免疫反应和细胞防御途径（Fig4 D）。
Pearson 相关分析评估了每个亚群中克隆组合之间的关系（Fig4 F）。发现4个耗竭性CD4+T细胞群聚集在一起，4个耗竭性CD8+T细胞群也聚集在一起，表明它们具有相似的TCR特征.
而且CD8_EM 和 CD8_TE 之间也聚集在一起。与其他 T 细胞亚群相比，这2群（CD8_EM 和 CD8_TE）与耗竭性 CD8+ 群体共享更多的TCR。耗竭性群体与 CD8_TE 和 CD8_EM 之间共享的克隆数分别为 30/2133（1.41%）和 28/2133（1.31%）。而其他 T 细胞簇也与耗竭性群体共享“有限”的 TCR（Fig 4G）。这些数据表明，不同的 T 细胞亚群绝不是完全孤立的，它们可能会经历广泛的状态转换。他们推测耗竭性CD8+、CD8_TE和CD8_EM细胞群体可能具有相同的来源或者说是分化途径有交联。同样地，耗竭性CD4+簇和CD4_TE也存在这种情况。
总结
这篇文章的讨论部分我展示一点，其他的大家有兴趣的话可以去看原文。作者他们发现B-ALL中有2群特异性的耗竭性T细胞亚群（CD8_TE 和CD4_TE ），而且耗竭性T细胞亚群不是离散状态，而是包含了不同的状态。有一些耗竭性细胞群体显示出细胞毒性评分较低的navie特征，而其他细胞表现有较高的增殖分数，并且耗竭评分相对较低。已知，naive样的耗竭性T细胞在经过抗检查点治疗后会大量增殖。他们推测这些细胞可能只是在耗竭程序积累期间开始出现增殖特征，而随着时间的推移会逐渐失去了它们的增殖特征。例如在2019年cell的一篇黑色素瘤的文章中(PMID:PMC7253294),可以看到，CD8 T细胞实际上处于高度增殖，克隆和动态分化的阶段，而这种高度增殖能力主要与功能失调程序的初始启动积累有关，而更advanced的功能失调性细胞则失去了这种增殖特征。
总的来说，这篇文献揭示了B-ALL中CD45+CD3+ T细胞在聚类，免疫活性和异质性方面的详细特征，描绘的B-ALL中T细胞的表征将有助于更好地了解基于免疫疗法靶向B-ALL有效性的潜在机制。
