作者，Evil Genius
基因组 + 单细胞 + 空间，这个多组学的组合，我个人认为是个风口，但是，从取样到分析都不容易。
今天我们分享多组学文献，一作是中国人。
知识积累
组蛋白H3第27位赖氨酸突变成甲硫氨酸突变（H3-K27M）最常见于儿童脑桥弥漫性中线胶质瘤（DMG），但在成人患者中也日益被发现。
采用单细胞多组学和空间转录组学技术，对涵盖多年龄段和多解剖部位的H3-K27M DMG队列进行深入分析。通过解析共同K27M突变背景下年龄和部位依赖性环境如何影响细胞内外特征，揭示了胶质瘤空间和细胞结构变异的决定机制。
结果1、跨越不同年龄组和发病部位的H3-K27M弥漫性中线胶质瘤患者队列
对50例H3-K27M突变患者肿瘤进行了多组学分析
对43例肿瘤进行了深度全长Smart-seq2新鲜单细胞（18例）或冻存单细胞核（25例）RNA测序（scRNA-seq/snRNA-seq）。此外，通过测序技术分析了8例肿瘤的开放染色质图谱（scATAC-seq/snATAC-seq），并采用原位测序技术解析了14例肿瘤的单细胞空间转录组结构。
为识别其他突变，我们对50例肿瘤中的43例进行了全外显子组或靶向外显子组测序。
TP53、PDGFRA和PIK3CA的 recurrent突变在所有按年龄和部位分层的临床解剖组中广泛存在，而HIST1H3B和BRAF改变仅在儿童肿瘤中偶有检测。
结果2、不同年龄与发病部位的H3-K27M DMG细胞组成特征
研究通过单细胞多组学分析发现：H3-K27M突变型弥漫性中线胶质瘤（DMG）普遍存在少突胶质前体细胞（OPC）样特征，该特征不受患者年龄或肿瘤部位影响，表明其由K27M突变本身的内在机制驱动；相反，间充质样（MES）特征显著富集于成人肿瘤，且与遗传突变无关，提示微环境等外在因素主导其形成。研究首次在DMG中发现胶质母细胞瘤特有的MES样细胞群，并通过基因调控网络分析揭示了SOX10、TFEB等正常胶质发育关键因子在肿瘤细胞中的异常活化，同时鉴定出GLI2、NFATC4等胶质瘤特异性调控异常。
结果3、OPC样细胞亚群的部位特异性分布
空间分布分析揭示这些亚群具有部位特异性：脑桥肿瘤显著富集pre-OPC样细胞（OPC样-2/3），而丘脑肿瘤则以成熟OPC样细胞（OPC样-1）为主。这种分布模式在控制年龄因素后仍然存在，表明肿瘤部位是决定OPC样细胞状态的关键环境决定因素。该发现首次系统揭示了H3-K27M DMG中OPC样细胞的分化异质性及其与解剖位置的关联。
结果4、H3-K27M DMG细胞群体的开放染色质图谱特征
为解析H3-K27M DMG细胞异质性的染色质调控机制，通过snATAC-seq检测了8例肿瘤的单核可及染色质图谱，与其单细胞转录组数据形成互补分析。
通过关联snATAC-seq检测的可及染色质区域与邻近基因表达水平，我们鉴定出13,632个潜在CRE-靶基因对。其中287个基因具有高度复杂的调控位点（含>8个CREs），被定义为"预测性染色质"关联基因（GPCs）。OPC/OC样细胞中GPCs数量显著多于AC/MES样细胞，表明少突胶质细胞谱系协同调控在H3-K27M DMG中占主导地位。这些GPCs与H3-K27M肿瘤超级增强子调控基因显著重叠，提示其在协调肿瘤细胞身份中的核心作用。
通过整合scRNA-seq推断的TF活性与snATAC-seq分析的TF结合motif富集，重建了基因调控回路，鉴定出65个细胞状态特异性转录因子。以OPC样标记基因SEZ6L为例：该基因在OPC样细胞中差异表达且染色质可及，其16个关联CREs中含有SOX8结合位点，而SOX8本身在OPC样细胞中呈现差异活性。所有肿瘤细胞状态的GPCs均显示基因表达、染色质可及性与特异性TF富集的三维互作关系（如AC样标记基因ITPKB受SOX9/NFATC4/RFX3调控网络支配）。
通过多组学整合揭示：单细胞染色质可及性谱独立验证了H3-K27M DMG的主要细胞谱系分类；GPCs作为大型调控复合物的核心组件，在OPC/OC样细胞中特异性富集，进一步强化了少突胶质细胞谱系在H3-K27M DMG中的核心地位。
结果5、H3-K27M DMG中年龄特异性的髓系细胞图谱
通过年龄与部位分层队列，重点解析了肿瘤相关髓系细胞（TAMs）的组成特征。发现成人患者髓系细胞中单核来源巨噬细胞比例显著更高，而儿童患者则以脑驻留小胶质细胞为主，这种差异与肿瘤部位无关
机制研究表明：成人TAMs高表达OSM配体，其相应受体OSMR在成人肿瘤细胞中同步上调，激活了已知诱导间充质表型的OSM-OSMR信号通路。成人TAMs中MES样标记基因表达也显著升高。通过对正常小鼠脑髓系细胞图谱的分析，发现OSM等配体和MES标记基因的表达随年龄增长而升高，证实H3-K27M DMG中MES样状态的年龄依赖性富集与正常脑部髓系细胞随发育衰老的变化趋势一致。
研究还揭示了TAMs与OPC样亚群间的配体-受体互作网络，既存在OPC谱系共性互作（如SEMA3E-PLXND1），也存在亚群特异性互作，提示微环境因素可能通过不同机制强化OPC样谱系并影响其成熟度。
成人H3-K27M DMG中单核来源巨噬细胞的优势浸润与肿瘤细胞MES样状态密切相关，这种年龄特异性的免疫微环境通过分泌OSM等配体诱导肿瘤细胞间充质化转变。该发现阐明了年龄相关微环境因素如何差异化塑造肿瘤细胞状态的新机制。
结果6、H3-K27M DMG的单细胞空间结构解析
通过基于杂交的原位测序技术（HybISS），对16例患者肿瘤组织切片进行空间转录组分析，使用从scRNA-seq数据筛选的116个细胞类型特异性标记基因。空间细胞分型（pciSeq）显示：AC样细胞构成主要恶性细胞区室，这与scRNA-seq中OPC样细胞占主导的现象形成鲜明对比。空间分析还检测到更丰富多样的非恶性细胞类型，且成人肿瘤中MES样细胞比例显著高于儿童肿瘤，正交验证了年龄与MES样状态的关联。
邻域富集分析揭示了显著的空间异质性。全局分析发现OPC样/周期细胞与OC样细胞存在更高共定位，通过CODEX多色免疫荧光技术在蛋白水平验证了这一发现——增殖性OPC样和OC样细胞形成有丝分裂生态位，外围由分化型AC样细胞环绕。血管细胞与MES样肿瘤细胞空间邻近性更高，提示间充质状态与血管增生的关联。小胶质细胞/巨噬细胞与MES样、OC样和AC样癌细胞也显示增强共定位。
通过计算聚类系数和度中心性，发现AC样细胞、非恶性星形细胞和TAMs倾向于异质性聚类（与其他细胞类型混合），而血管细胞、神经元和周期OPC样细胞更倾向同质性聚类（形成特定结构/生态位）。
本研究首次在原生肿瘤组织中解析了scRNA-seq定义的H3-K27M DMG细胞群体的空间结构，揭示了少突胶质细胞谱系肿瘤细胞（OPC样和OC样）共定位形成的有丝分裂干细胞样生态位，为开发针对肿瘤区域特异性生态位的治疗策略提供了新方向。
本研究通过构建H3-K27M弥漫性中线胶质瘤的多组学单细胞图谱，揭示了时空背景下肿瘤异质性的双重调控机制：一方面，K27M突变通过细胞内在效应普遍驱动肿瘤细胞向OPC样状态分化（与年龄和部位无关）；另一方面，脑桥肿瘤富集更幼稚的前体OPC样细胞（部位特异性），而间充质样特征随年龄增长显著增强（时间特异性），后者与年龄相关的髓系细胞微环境变化密切相关。空间分析首次发现少突胶质谱系肿瘤细胞（OPC样/OC样）形成的增殖性生态位，同时挑战了单细胞测序中OPC样细胞占主导的认知——原位分析显示AC样细胞才是主要肿瘤群体，提示技术方法对细胞捕获存在偏好性。该研究为理解时空因素如何协同塑造肿瘤细胞状态提供了全新框架，为针对不同临床解剖亚组开发精准治疗策略奠定了理论基础。
最后来看看方法
单细胞部分
scRNA + scATAC联合分析
空间邻域分析
