这篇文章于2023年5月以封面文章的形式发表于The Journal of Clinical Investigation（IF=15.9，Targeting hypoxia-inducible factors with 32-134D safely and effectively treats diabetic eye disease in mice），是一篇探讨新治疗靶点对存在治疗难题疾病治疗效果提升的文章，主要是对新靶点的验证思路以及后续的靶向新靶点药物的筛选实验设计比较有意思，相关同学可以借鉴一下。

研究意义：糖尿病视网膜病变（Diabetic retinopathy，DR）是糖尿病最常见的微血管并发症，是糖尿病导致的视网膜微血管渗漏和阻塞从而引起一系列的眼底病变，如微血管瘤、硬性渗出、棉絮斑、新生血管、玻璃体增殖、黄斑水肿甚至视网膜脱离。DR以是否有从视网膜发出的异常新生血管作为判断标准，可分为增殖性糖尿病视网膜病变（Proliferative diabetic retinopathy，NPDR）和非增殖性糖尿病视网膜病变（Nonproliferative diabetic retinopathy，NPDR）（图1）。晚期糖基化终末产物、氧化应激和炎症等均可以导致视网膜神经血管损伤→缺血和促血管生成因子表达增加→血管新生→NPDR进展为PDR。糖尿病性黄斑水肿（Diabetic macular edema，DME）是糖尿病视网膜病变的另一重要改变，没有视网膜缺血时也可发生。值得注意的是，临床50%以上的PDR和DME患者对常规抗VEGF疗法应答不理想，亟需找到新治疗靶点和药物。低氧诱导因子（Hypoxia-inducible factors，HIFs）是调控视网膜血管疾病相关血管活性调节蛋白的重要转录因子，且HIF1α和HIF2α在缺血性视网膜疾病里显著增加【1】。考虑到非缺血情况下也能检测到VEGF表达上调，而HIFs通常在缺氧条件下才会发生蛋白积聚并发挥功能，因此有研究认为DME患者VEGF表达增加与HIFs无关。但最近有研究指出，许多糖尿病眼病相关的炎症因子和生长因子可以通过非缺氧依赖的方式增强HIFs活性（即HIFs表达增加存在非经典调控通路）。所以，HIFs的非经典调控能否影响NPDR/DME呢？结合“HIFs可以促进缺血视网膜组织VEGF、VEGFR2、EPO、PDGFB、ANGPTL4、MMPs和PAI-1的转录表达，但对生理状态下上述基因的表达没有显著影响“这一现象，因此HIFs有可能成为糖尿病视网膜病变治疗的新靶点。

图1

研究策略： 本篇文章主要聚焦于糖尿病视网膜病变，探究了HIFs转录因子作为其主要病理改变NPDR和PDR的新治疗靶点，以及靶向HIFs的多个抑制剂对它们的治疗作用。主要根据“临床已有治疗方法效果不理想，需要新的治疗靶点和药物→HIFs有可能作为其新治疗靶点→体内体外利用其抑制剂进行实验验证→确定其可以作为糖尿病视网膜病变的新治疗靶点，并确定其抑制剂可以作为潜在治疗药物“这一逻辑链进行实验验证。比较幸运的是，他们发现HIFs是可以作为新治疗靶点的，且通过药物筛选和实验，他们排除了已有的两个HIFs抑制剂作为新治疗药物的可能，并找到了一个更加安全且特异性更高的HIFs抑制剂32-134D，因此具有较大的临床意义。

研究方法：

1、抗VEGF治疗不影响PDR患者晶状体HIFs调控的血管活性调节蛋白表达，但抑制HIFs可以抑制其表达和血管新生

      作者先检测了PDR患者眼部组织HIF依赖的血管活性调节蛋白在抗VEGF疗法治疗中的表达改变。PDR患者由于持续的高血糖状态会导致视网膜血管损伤，进而引起缺氧和血管新生（图2A）。虽然PDR患者VEGF以及其它HIF依赖的血管活性调节蛋白表达均显著增加（ANGPTL4、ANGPT2、EPO和MMP-2）,但这些调节蛋白的表达不受抗VEGF治疗的影响（图2B-C）。作者还利用低氧诱导的视网膜病变模型小鼠探究了HIFs对视网膜血管新生的影响。结果显示，HIFs抑制剂地高辛显著抑制HIF依赖的血管活性调节蛋白表达以及小鼠的血管新生（图2D-E）。因此，HIFs是治疗PDR的潜在靶点。

图2

2、抗VEGF治疗不影响DME患者眼房组织HIFs调控的血管活性调节蛋白表达，但抑制HIFs可以抑制其表达并降低血管通透性

      接下来，作者检测了抗VEGF疗法对DME患者眼部组织HIF依赖的血管活性调节蛋白表达的影响。NPDR患者由于视网膜血管损伤，会导致微血管瘤的发生和血管通透性增加，最终导致DME（图3A）。检测NPDR/DME患者的眼房组织发现，HIF依赖的血管活性调节蛋白ANGPTL4和ANGPT2表达显著增加，而抗VEGF疗法对二者表达没有显著影响（图3B）。接下来，作者用STZ诱导的糖尿病模型小鼠模拟DME并检测HIFs对其进展的影响。与DME患者类似，STZ小鼠视网膜组织不存在缺氧的情况，但STZ小鼠病变视网膜组织HIF1α和HIF2α水平显著增加，表明糖尿病视网膜病变HIFs受非经典通路调控（图3C-D）。相应的，受HIF转录调控的血管活性调节蛋白VEGF和ANGPTL4表达增加（图3E）。用地高辛抑制HIFs可显著抑制VEGF和ANGPTL4表达，降低血管通透性（图3F-G）。因此，HIFs是治疗NPDR/DME的新靶点。

图3

3、HIF抑制剂Acriflavine只能以脱靶的方式抑制视网膜病变

      由于地高辛药代动力学复杂且可用治疗范围有限，因此，难以将其作为糖尿病视网膜病变治疗的潜在药物，所以作者接下来评估了另一靶向HIFs的抑制剂acriflavine在糖尿病视网膜病变里的治疗作用。STZ糖尿病小鼠在注射了acriflavine后视网膜血管渗透性显著下降，且单次注射的缓解效果可维持3个月（图4A-B）。但视网膜电图（Electroretinogram，ERG）的结果表明，较高剂量的acriflavine会显著影响视网膜功能，即有毒性（图4C）。检测处理过STZ小鼠的视网膜，发现其神经节细胞层（GCL）显著变薄，神经节细胞（RGCs）显著减少，但低氧诱导的视网膜病变Hif1a+/–和Hif2a+/–模型小鼠RGCs却没有显著改变，提示acriflavine对视网膜细胞作用是药物脱靶导致的（图4D-F）。因此，acriflavine的长期较高剂量使用会破坏视网膜，且其对糖尿病视网膜病变的缓解作用是药物脱靶所致。

图4

4、HIF的新抑制剂32-134D通过促进HIF1α和HIF2α蛋白酶体降解抑制HIFs调控的血管活性调节蛋白表达

      由于HIFs抑制剂地高辛和acriflavine无法作为糖尿病视网膜病变的备选药，作者尝试检测另一个新近报道的HIFs抑制剂32-134D对糖尿病视网膜病变的治疗作用【2】。32-134D显著抑制低氧条件下视网膜细胞HIF1α和HIF2α的蛋白聚集（图5A）。接下来，作者检测了蛋白酶体和溶酶体这两条蛋白降解主要途径在32-134D促进HIFs降解过程里的作用。抑制溶酶体途径对该过程没有显著影响，但抑制蛋白酶体途径能显著缓解其促降解作用（图5B-C）。因此，32-134D通过促进蛋白酶体途径抑制HIF1α和HIF2α蛋白的聚集，从而抑制HIFs相关信号通路。对依赖HIF的血管活性调节蛋白表达的检测显示，32-134D显著抑制缺氧引起的促血管新生基因表达上调（图5D）。由于血管内皮细胞也分泌促血管新生因子以促进糖尿病视网膜病变进展，作者检测了32-134D对原代内皮细胞HUVECs的HIFs蛋白表达和促血管新生基因表达的影响，结果与视网膜细胞相同（图5E-F）。此外，作者还利用人诱导多能干细胞构建的视网膜类器官（含有几乎所有的视网膜细胞特异性细胞）对32-134D的作用进行了检测，结果同上（图5G-H）。因此，32-134D通过促进HIFs的蛋白酶体降解抑制其功能。

图5

5、32-134D抑制视网膜病变模型小鼠HIFs蛋白和下游基因表达，缓解视网膜病变，且没有显著毒性

      接下来作者在小鼠体内水平验证了32-134D对视网膜病变和HIFs通路的影响。腹腔给予视网膜病变模型小鼠32-134D显著抑制HIF1α和HIF2α蛋白聚集，以及受其调控的血管活性调节因子表达和血管新生（图6A-C）。为避免全身给药可能带来的毒性作用，作者还评估了眼球局部给药对小鼠视网膜正常结构和功能的影响。结果显示，局部给药对视网膜正常功能和结构没有显著影响（图6D-E）。因此， 32-134D可能成为治疗糖尿病视网膜病变的新药物，且没有明显的毒副作用。

图6

6、眼部注射32-134D逆转缺氧对视网膜组织转录组的改变并改善视网膜病变

      优化了32-134D眼部给药的药物动力学之后（原文有详尽的实验设计，做新药体内实验药代的同学可以参考），作者进一步探究了眼部给药对视网膜组织病理改变以及分子层面改变的影响。RNA-seq的结果表明，眼部注射32-134D显著逆转缺氧对视网膜组织转录组的改变（图7A-B），且眼部注射32-134D显著抑制HIF1α和HIF2α蛋白聚集、促血管新生基因表达以及血管新生（图7C-E）。此外，眼部注射32-134D显著缓解STZ糖尿病小鼠视网膜血管的高渗状态（图7F）。所以，32-134D对糖尿病视网膜病变具有更好的治疗效果和适用范围，可作为临床治疗糖尿病视网膜病变的备选用药。

图7

Take-home message：

      这篇文章主要聚焦于临床问题“糖尿病视网膜病变已有治疗方法治疗效果不理想”，因此作者根据文献调研想探究HIFs这一低氧相关转录因子作为这种疾病治疗靶点的可行性。科学问题的提出没有特别亮眼的地方，主要还是多看文献、多思考、多做预实验（+多祈祷），也没有太多机制方面的阐述验证。需要指出的是，作者的研究目的比较明确可能是由于其同事刚在同一期刊发表了HIFs新抑制剂相关的文章，同时结合自身的文献调研，便将HIFs与这个疾病联系到了一起。有了开头（种子），后面便是利用细胞和动物模型探究其抑制剂作为治疗该疾病新药物可行性的评估。比较有意思的是，在证实了已有药物的缺陷后，作者利用同事在2022年发现的HIFs抑制剂进行实验，解决了已有抑制剂安全性和特异性不足的难题，为文章增加了新颖性和实用性，亦为基础和临床相关问题的解决提供了重要线索，可能这也是这篇文章成为JCI封面文章的原因。

【参考文献】

1. Paulus, Y. M. et al. Anti-angiogenic Therapy for Retinal Disease. Handb Exp Pharmacol 242, 271, doi:10.1007/164_2016_78 (2017).

2. Salman, S. et al. HIF inhibitor 32-134D eradicates murine hepatocellular carcinoma in combination with anti-PD1 therapy. J Clin Invest 132, doi:10.1172/JCI156774 (2022).