目前，纯生信分析发文依然是如火如荼，但随着审稿人的审美疲劳，其口味也越来越挑。纯生信文章不再那么容易满足审稿人的味蕾了，所以，“生信分析+实验验证”也是目前生信类高分文章的整体套路。到底怎样将生信分析与实验验证完美的整合呢？今天，一起学习一篇6.68分的文章，看看 “别人家的套路吧”！
【生信+实验验证最好的思路是：单基因】
文章的题目是：Identification of AUNIP as a candidate diagnostic and prognostic biomarker for oral squamous cell carcinoma.
下面，和大家一起分解作者的套路：
一、研究材料
临床样本
包含89个口腔鳞状细胞癌(OSCC)样本和16个正常对照样本(癌旁组织) 组织微阵列芯片。另外是4对OSCC和相匹配的正常口腔组织样本。这些临床样本均含有临床病理特征的数据。
生信数据
从GEO数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中选择了GSE30784，GSE3524，GSE78060，GSE41613四张芯片，然后下载原始文件（.CEL文件）和平台文件(GPL文件)。使用R/Bioconductor中的“affy包”和“impute包”对每个GEO数据集的矩阵数据进行背景校正，归一化，log2转换和缺失值补充。GEO数据就处理完了。通过TCGA数据库（https://www.cancer.gov）和FireBrowse数据库（http://www.firebrowse.org）中下载与OSCC相关的相关文件（.count文件）和临床信息。
二、上调差异表达基因(DEG)的筛选
以log2FoldChange(FC)＞1且adjusted P-value＜0.01作为上调差异基因的筛选标准，筛选GSE30784, GSE3524，and GSE78060三张芯片中上调的差异基因，然后求三张芯片的交集，最终筛选出来了90个重叠的上调的DEG,再利用TCGA数据库对这90个上调的DEG进行验证，结果是一致的。
上调的DEG交集的韦恩图：
TCGA数据库验证的热图：左边是正常组织，右边是肿瘤组织。
三、鉴定诊断OSCC的关键基因
通过ROC曲线分析，并比较AUC值，以评估上述90个候选基因在TCGA数据库中诊断OSCC的敏感性和特异性。根据其AUC值（＜0.940）列出了TOP10基因，表明这些基因对OSCC的诊断意义最高。为了验证这10个基因对OSCC的诊断意义，再次在GSE30784数据集中进行了ROC曲线分析。
AUNIP在癌症中的表达和功能不明确，因此，作者提出了AUNIP作为本研究的目标基因。确定了目标基因后，建立Logistic回归模型，以进一步评估AUNIP在诊断OSCC中的有效性。通过构建五倍交叉验证的AUNIP的ROC曲线和混淆矩阵，结果明确了AUNIP在OSCC样本中的诊断价值。
四、AUNIP的高表达与OSCC的进展和
肿瘤纯度的分析
利用TCGA数据，首先是正常样本与肿瘤样本的差异比较(a)；其次分析了AUNIP的不同表达水平与OSCC患者临床病理特征之间的相关性，HPV感染、基质评分、免疫评分、组织学分级、肿瘤T分期这五个特征均得出了有统计意义的差异。
通过分析，AUNIP的表达与ESTIMATE得分(使用TCGA样本的表达数据估计恶性肿瘤组织中的基质细胞和免疫细胞的值)呈负相关，表明AUNIP与OSCC的肿瘤纯度呈正相关。
最后，再通过Western blotting和IHC染色检测AUNIP的蛋白表达，其结果与OSCC组织中的mRNA表达一致。Western显示了OSCC患者中AUNIP过表达（图a）。在IHC染色中，与正常对照（图b-c）和成对的相邻正常口腔组织（图d）相比，OSCC组织中的AUNIP过表达。通过IHC染色的ROC曲线分析获得的AUC值为0.725，且具有统计学意义，支持AUNIP对OSCC的诊断价值（图f），并且AUNIP蛋白表达随着恶性肿瘤的进展而增长（通过组织学等级的改变来反映：图c；图e）。以上实验得出了AUNIP在OSCC中的潜在致癌作用的结论。
五、WGCNA网络构建和关键模块的识别
还记得之前剩下的一个GEO芯片GSE41613吗？GSE41613数据集包括97名OSCC患者，并提供详细的总体生存信息，适合于WGCNA的构建。所以可以将模块特征基因与OSCC患者的生存数据联系起来。通过WGCNA，发现黄色模块与OSCC患者的生存时间最相关，而AUNIP是MM>＞0条件下的基因之一，因此，AUNIP被认为是黄色模块中的中枢基因之一。
六、基因功能注释和GSEA
为了进一步探索AUNIP在OSCC中的潜在生物学功能，作者基于WGCNA中的拓扑重叠构建了与AUNIP正相关的134个基因的网络（图b），发现这些基因在306个来自TCGA数据库的OSCC样本中的表达谱数据相似（图c）。
对这些基因进行GO和KEGG的分析。
AUNIP在OSCC中的GSEA分析。
鉴于关键分子在OSCC的细胞周期调控，DNA修复和HPV感染中起着至关重要的作用。通过相关分析来评估TCGA数据库的OSCC样本中的AUNIP与几个基因之间的关系。最终推断AUNIP可以调节有丝分裂细胞周期的进程，与OSCC中的HPV感染有关，并在肿瘤发生过程中起重要作用。
七、细胞实验验证
为了验证上述生物信息学分析的结果，在SCC-9和SCC-15两株OSCC细胞系中将AUNIP敲减（图a，b）。AUNIP完全敲出后，OSCC细胞中的集落形成显着减少（图 c）。
流式细胞仪分析细胞周期，如图d。观察到AUNIP敲减后的OSCC细胞停滞在G0/G1期，证实了AUNIP在控制细胞周期进程中的重要作用。
八、AUNIP的高表达与OSCC的预后的关系
AUNIP具有潜在的致癌能力，值得探讨AUNIP在OSCC中的预后价值。GSE41613和TCGA数据中，将AUNIPmRNA表达与临床预后数据结合，进行Kaplan-Meier生存分析和Log-Rank检验，均发现AUNIP的高表达与OSCC的预后不良相关。
最后，分别进行单因素和多因素分析。单因素分析发现具有统计学意义的7个指标是AUNIP表达，放疗，淋巴管浸润，神经侵犯，肿瘤分期，肿瘤T期和肿瘤N期。多因素分析表明，AUNIP可被视为OSCC的独立预后的指标。
套路总结
1、TCGA和GEO数据的下载和上调的差异基因的筛选，及两个数据库相互验证；
2、通过ROC曲线分析及AUC的比较，鉴定出诊断OSCC的关键基因，确定候选的目标基因；
3、目标基因的表达与肿瘤纯度和肿瘤进展的生信分析，WB和免疫组化检查蛋白表达与基因表达的一致性；
4、WGCNA识别关键模块及鉴定中枢基因；
5、与目标基因相关的基因的功能注释(GO/KEGG)和目标基因的GSEA；
6、细胞实验验证：主要是针对目标基因功能的验证，包括基因敲减和流式检测。
7、预后的分析：生存曲线绘制、单因素和多因素分析。
8、得出实验结论：肿瘤诊断及预后的标记物。
