大多数实验人员遵循的一般原则是10 U的限制性内切酶足以克服DNA来源、数量和纯度的不确定性。通常是在50 μl体系，适合的 1×反应缓冲液中，1 μg纯化的 DNA 中加入1 μl酶，，然后在推荐温度下孵育1小时。如果使用了过量的酶，为了省时，通常可以缩短孵育时长。
为了保证反应体系中甘油浓度低于5%，以 50% 甘油形式提供的限制性内切酶不应超过总反应体积的 10%。
一个成功的限制酶消化的一个极其重要但经常被忽视的因素是混合。反应必须充分混合才能实现完全消化。建议轻柔地上下吹打反应混合物或轻弹管壁。然后在微量离心机中瞬离。切勿涡旋，更多体系和限制酶反应的具体信息，请参阅对应每个限制酶的产品说明书。
