文献分享（xenium）--空间组织化的 SPP1⁺ 巨噬细胞与 CD1C⁺ 常规树突状细胞相互作用，共同塑造 EGFR 突变型非小细胞肺癌的免疫抑制性生态位

作者，Evil Genius

单细胞 + 空间组学这是目前发文的利器，也从侧面说明了多组学是未来的方向，尤其在靶向治疗层面，基因组 + 单细胞空间是研究治疗效果的最佳组合，至于分子对接分子动力学，则偏向于药物开发。

大家做项目分析养成良好的习惯，任何数据的临床信息或者相关信息都整理好，方面后续的分析研究，千万不要需要分析的时候再去找。

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整体研究背景与核心问题

EGFR突变非小细胞肺癌（NSCLC）从免疫检查点抑制剂（ICI）治疗中获益有限，但与耐药相关的空间免疫机制尚不清楚。我们应用单细胞分辨率的多模态空间蛋白质组-转录组学框架，整合成像质谱流式（IMC；n=12）和基于Xenium的空间转录组学（n=8），绘制了化疗免疫治疗后EGFR突变NSCLC的肿瘤微环境图谱。纳入单细胞RNA测序数据集（n=11）用于细胞-细胞相互作用推断和通路分析。空间 profiling 显示，非主要病理缓解（non-MPR）肿瘤富集含有SPP1⁺巨噬细胞和CD1C⁺常规树突状细胞（cDC）的免疫抑制细胞邻域。这些CD1C⁺ cDC表现出免疫激活和抗原呈递程序减少。空间距离分析显示，non-MPR肿瘤中SPP1⁺巨噬细胞与CD1C⁺ cDC之间的距离比MPR肿瘤更近。配体-受体分析识别出候选的巨噬细胞来源信号，与CD1C⁺ cDC状态改变相关，这得到基于Xenium的共定位和空间相互作用CD1C⁺ cDC中促炎程序减少的支持。总之，这些发现提示SPP1⁺巨噬细胞-CD1C⁺ cDC空间生态位与免疫治疗反应降低相关，可能为未来恢复EGFR突变NSCLC中DC免疫原性的策略提供信息。

研究背景：

  • EGFR突变在亚洲NSCLC患者中约占49.1%，西方患者中约占12.8%。
  • 第三代EGFR酪氨酸激酶抑制剂（TKI）是晚期EGFR突变NSCLC的一线治疗基石，但获得性耐药不可避免。
  • ICI在EGFR突变NSCLC中的疗效有限，单药或联合化疗均表现不佳。抗PD-1+抗VEGF受体+化疗的组合显示出一定前景。
  • EGFR突变NSCLC具有独特的生物学和临床特征，需要阐明肿瘤内在和微环境耐药机制。
  • 肿瘤微环境（TME）是ICI反应的关键决定因素，但EGFR突变NSCLC的空间免疫机制尚未被系统研究，尤其是治疗后样本。

结果部分 1：EGFR突变NSCLC不同免疫治疗反应患者的空间 profiling 和细胞组成

  • 研究设计：
    • 内部队列：EGFR突变NSCLC接受化疗免疫治疗后的FFPE样本，用于IMC（n=12）和Xenium空间转录组学（n=8）。分为三组：初治（naive，n=4）、non-MPR（n=5）、MPR（n=3）。
    • 外部队列：来自Zhang等人前瞻性新辅助临床试验的EGFR突变NSCLC接受新辅助化疗免疫治疗后的scRNA-seq数据（n=11，non-MPR n=7，MPR n=4）。
  • 临床特征：展示了患者的RECIST反应、组织学、EGFR亚型、吸烟状态、分期和周期数。
  • 影像与病理：展示了MPR和non-MPR患者的治疗前后CT影像和H&E病理图像。
  • IMC分析：
    • 抗体面板：包括PanCK、CD3、CD4、CD8、CD20、CD45、CD68、CD15、CD31、CD163、CD11c、CD14、CD1C、SPP1、VEGFA、HIF-1α、Ki-67、DNA等。
    • 主要细胞群：UMAP显示B细胞、PanCK⁺上皮、内皮、T/B细胞、CD4T、CD8T、基质单核/巨噬细胞、成纤维细胞、CD8⁺T、CD4⁺T、TAM、粒细胞、DC等。单核/巨噬细胞进一步分为Other Mac、M1-like RTM、M2-like RTM、Vimentin⁺Mac、SPP1⁺Mac、HIF-1α⁺RTM、增殖性单核细胞；T细胞分为CD3⁺CD4⁺、CD3⁺CD8⁺、细胞毒性CD8⁺、耗竭CD8⁺、记忆CD8⁺、Naive CD4⁺、Naive CD8⁺、Vimentin⁺Mac、Treg等。
    • 细胞比例：各患者中细胞群占总细胞的比例。
    • 空间分布：代表性样本中注释细胞类型的空间分布。
    • 细胞组成：各患者中免疫和基质细胞类型的组成条形图。
    • Ro/e分析：显示不同治疗反应组中细胞群的富集情况。non-MPR组中SPP1⁺Mac、HIF-1α⁺RTM、Treg、增殖性单核细胞、CD8⁺T、成纤维细胞等富集；MPR组中B细胞、CD4T、CD8T、M1-like RTM、CD1C⁺DC等富集。

结果部分 2：空间邻域分析揭示non-MPR EGFR突变NSCLC中SPP1⁺巨噬细胞与DC的免疫抑制相互作用

详细总结：

  • 细胞邻域（CN）定义：基于中心细胞及其最近25个细胞定义CN。
  • CN组成：代表性patch图显示MPR、non-MPR和naive组的CN组成。
  • 15个不同CN的鉴定：从28个细胞簇中鉴定出15个CN及其在各CN中的丰度。CN8定义为“SPP1⁺Mac&DC enriched”。
  • CN分布：naive、non-MPR和MPR组中CN的分布。
  • CN富集分析：Ro/e分析显示CN8（富含SPP1⁺巨噬细胞和DC）在non-MPR中显著富集。
  • 空间距离分析：non-MPR中SPP1⁺巨噬细胞与DC的距离显著近于MPR或初治组（P<0.0001）。
  • CN8分布比例：non-MPR组中79.3%的DC位于CN8内，而MPR组为37.9%，初治组为18.2%。SPP1⁺巨噬细胞呈现类似富集模式。
  • CN8空间定位：patch分析显示CN8在non-MPR的TME中最常见，MPR和初治组中显著较少。
  • DC邻域组成：non-MPR组中SPP1⁺巨噬细胞在DC周围细胞中的比例显著高于MPR和初治组。
  • DC patch中SPP1⁺巨噬细胞频率：non-MPR组中SPP1⁺巨噬细胞在DC patch中出现频率最高。

结果部分 3：SPP1⁺巨噬细胞-DC相关程序表征non-MPR肿瘤

详细总结：

  • scRNA-seq分析：对11例化疗免疫治疗后肿瘤（4 MPR，7 non-MPR）进行scRNA-seq分析。
  • 主要细胞谱系：T细胞、B细胞、髓系细胞、内皮细胞、成纤维细胞、浆细胞、上皮细胞。
  • 髓系亚群：进一步分为10个转录 distinct 亚簇，包括CD1C⁺ cDC、LILRA4⁺ pDC，以及表达SPP1、VEGFA、C1QC、GPNMB的巨噬细胞亚群。
  • GO富集分析：SPP1⁺巨噬细胞在白细胞和淋巴细胞介导的免疫调节中显著富集。
  • 髓系亚群比例：各患者中髓系亚簇的比例。
  • Ro/e分析：C1QC⁺巨噬细胞主要在MPR组富集，SPP1⁺巨噬细胞和肥大细胞在non-MPR组优先富集。
  • M1/M2极化：巨噬细胞亚群显示M2优先于M1，SPP1⁺巨噬细胞呈现特别明显的M2主导模式。
  • 代谢特征：SPP1⁺巨噬细胞在氧化磷酸化和丙酸代谢通路中富集，与免疫抑制代谢状态相关。
  • 转录因子活性：SPP1⁺巨噬细胞显示NFKB2和BCL6活性升高，与免疫抑制巨噬细胞编程相关。
  • 伪时间轨迹：从单核细胞（FCN1和FCGR3A）向终末分化巨噬细胞群的连续分化，SPP1⁺巨噬细胞主要位于晚期伪时间阶段。
  • T细胞分析：尽管治疗后细胞毒性CD8⁺T细胞丰度降低，但IFNG和细胞毒性效应基因在残留CD8⁺T细胞亚群中仍可检测到，提示T细胞区室的组成重塑而非细胞毒性效应潜能的完全丧失。
  • DC功能分析：
    • CD1C⁺ cDC富集于T细胞和淋巴细胞激活通路。
    • non-MPR组中CKLF上调，CKLF可招募CCR4⁺CD4⁺T细胞，与FOXP3⁺Treg富集和免疫抑制TME相关。
    • non-MPR组中胆固醇分解和乳酸代谢通路上调，T细胞趋化和IL-2产生下调。
    • CellChat分析显示non-MPR中SPP1⁺巨噬细胞与CD1C⁺ cDC之间信号相互作用数量更多。
    • NicheNet分析优先识别SPP1⁺巨噬细胞表达的候选配体，包括SPP1和TNF，预测调控CD1C⁺ cDC中的免疫相关靶基因。
    • 预测的下游反应基因中，IL-1β、NFKBIA、IRF1、CXCL10与炎症和免疫调节程序相关。

    • GO和GSEA分析显示non-MPR组中免疫激活和抗肿瘤通路显著下调，包括“αβT细胞激活”、“对TNF的反应”、“淋巴细胞分化”。


结果部分 4：空间转录组学支持non-MPR肿瘤中SPP1⁺巨噬细胞-DC邻近性增强和DC功能障碍

详细总结：

  • Xenium空间转录组学：

    • 鉴定出多个细胞群：CD4⁺T、CD8⁺T、B细胞、浆细胞、上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、中性粒细胞、肥大细胞，以及SPP1、C1QC、VEGFA、GPNMB巨噬细胞、CD1C⁺ cDC、LILRA4⁺ pDC等髓系亚群。
    • 标记基因表达验证各细胞类型。
    • 细胞群分布直方图：成纤维细胞和内皮细胞在MPR组更丰富，浆细胞在non-MPR中更常见。
    • Ro/e分析：MPR组B细胞和VEGFA巨噬细胞富集，non-MPR组SPP1⁺巨噬细胞、GPNMB巨噬细胞和中性粒细胞优先富集。
    • 空间分布图。
    • CD1C⁺ cDC功能差异：non-MPR中IL-2和IL-17信号通路下调，葡萄糖分解活性升高。
    • AUCell评分：non-MPR组CD1C⁺ cDC在炎症反应、淋巴细胞分化和激活相关通路中活性显著降低。

    • MPR肿瘤中B细胞显示更高的抗原呈递相关HLA基因表达。


  • 空间拓扑差异：

    • SPP1⁺巨噬细胞在non-MPR组CD1C⁺ cDC邻域中显著更富集。
    • 空间距离分析：non-MPR中CD1C⁺ cDC到最近SPP1⁺巨噬细胞的距离（双向）显著减少。
    • 髓系邻域组成：non-MPR组CD1C⁺ cDC的髓系邻域中SPP1⁺巨噬细胞比例显著更高。
    • SpaGene空间共定位：non-MPR（pt_8）中CD1C⁺ cDC被更高密度的SPP1⁺巨噬细胞包围。
    • CD1C⁺ cDC按空间距离分层：SPP1⁺巨噬细胞近端CD1C⁺ cDC表达更高免疫调节基因，远端CD1C⁺ cDC表达更高抗原呈递、炎症激活、迁移和T细胞共刺激基因。
    • Xenium配体-受体相互作用：SPP1⁺巨噬细胞与CD1C⁺ cDC之间一致的细胞间通讯模式。
    • AUCell评分：non-MPR中SPP1⁺巨噬细胞top配体基因和CD1C⁺ cDC中NicheNet预测靶基因均显著降低。

    • 总结示意图：SPP1⁺巨噬细胞可能通过空间富集的配体-受体相互作用损害CD1C⁺ cDC免疫刺激功能，导致EGFR突变NSCLC免疫治疗疗效降低。


讨论与局限性

  • 核心发现：通过整合scRNA-seq、IMC和Xenium空间转录组学，描绘了与免疫治疗次优反应相关的空间免疫特征。在non-MPR中识别出富含SPP1⁺巨噬细胞和CD1C⁺ cDC的空间组织细胞邻域。在这些区域中，CD1C⁺ cDC表现出免疫反应相关通路活性受抑制，提示SPP1⁺巨噬细胞可能通过空间相互作用抑制DC免疫原性，从而促进免疫抵抗。
  • TME的重要性：TME是ICI反应性的关键决定因素。肿瘤相关巨噬细胞、DC、Treg和基质共同编排决定治疗结局的免疫生态系统。大多数EGFR突变NSCLC分析限于初治样本，显示免疫抑制景观（TIL减少、抗原呈递受损、CD8⁺TRM减少）。Zhang等人显示化疗免疫治疗耐药的EGFR突变NSCLC富集CCR8⁺Treg和有限的CXCL13⁺耗竭T细胞扩增。但空间相互作用尚未被系统研究。
  • 空间相互作用而非细胞丰度：尽管CD1C⁺ cDC频率在MPR和non-MPR间无显著差异，但CD1C⁺ cDC和SPP1⁺巨噬细胞的空间聚集在non-MPR中显著富集。scRNA-seq和Xenium均支持两者间配体-受体相互作用增加。
  • SPP1⁺巨噬细胞：先前已涉及通过与成纤维细胞、T细胞和浆细胞相互作用介导免疫逃逸，本研究将这一范式扩展到支持DC功能改变作为SPP1介导免疫调节的潜在组成部分。
  • DC功能与EGFR信号：EGFR 19del突变中，肿瘤介导的外泌体信号损害DC成熟并减少T细胞浸润。EGFR突变NSCLC中成熟MHC-II高DC显著减少。本空间数据提示SPP1⁺巨噬细胞与CD1C⁺ cDC的密切邻近可能限制DC成熟，导致免疫治疗抵抗。
  • 治疗意义：增强DC活性是改善免疫治疗疗效的新兴策略。瘤内递送FLT3L激活的DC可克服ICI抵抗，DC疫苗可能与ICI协同。早期临床试验显示DC疫苗联合ICI安全性良好。除ICI+DC外，加入重塑免疫抑制TME的药物（如TKI或化疗）可能进一步增强疗效。
  • 局限性：
    1. 样本量相对较小，反映特定临床场景的罕见性（化疗免疫治疗非EGFR突变NSCLC一线常规，且需治疗后手术标本）。
    2. 单中心设计可能限制普适性。
    3. 计算工具识别了推定配体-受体相互作用，但需体外共培养或体内扰动进行功能验证以建立因果关系。
    4. 主要关注肿瘤免疫微环境，未全面表征癌细胞状态或肿瘤内在程序。
    5. 基于ROI的分析可能引入采样偏差，尽管ROI由经验丰富的病理学家在盲法下使用预定义标准选择。
    6. 每种组学模式捕获单一时间点的TME，限制动态演变评估。未来需纵向采样、专门肿瘤细胞 profiling、活组织成像和机制验证。

方法部分

  • 患者与样本：来自浙江大学医学院附属第一医院的EGFR突变NSCLC接受化疗免疫治疗后的FFPE标本，用于IMC和Xenium。scRNA-seq数据来自公开的新辅助化疗免疫治疗EGFR突变NSCLC队列。伦理批准号IIT20240637B。
  • IMC采集与分析：连续4 μm FFPE切片，68°C孵育1 h。使用IMC抗体面板染色，数据采集与分析。
  • Xenium采集与分析：与LC-Bio合作，从FFPE样本构建TMA（8个1.6 mm核心），选择免疫细胞浸润显著区域。使用Xenium Prime 5K Human Pan Tissue & Pathways Panel（5001基因）。切片5 μm，标准处理包括脱蜡、解交联、酶消化、探针杂交连接、原位信号放大。Xenium Analyzer运行约90 h。
  • 数据分析：
    • Seurat加载和分析Xenium输出数据，SCTransform标准化，UMAP聚类。
    • RCTD解卷积空间转录组数据为细胞类型，使用scRNA-seq参考。
    • SpaGene识别共定位配体-受体对介导的细胞间通讯。
    • CellChat推断细胞间通讯强度，NicheNet优先识别候选配体及预测下游靶基因。
    • scMetabolism探索代谢特征，转录因子活性评分分析。
    • Monocle3伪时间轨迹分析。
    • GO和GSEA功能富集分析。
  • 统计分析：R软件（v4.5.0），Wilcoxon检验，P<0.05显著。

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